基于PI3K／Akt／FoxO1 通路探讨大黄酸对2 型糖尿病大鼠肾损伤的作用

乔 进，赵 彦，陈 霞，窦志华*，孟国梁，吴 锋，徐济良

（1.南通大学附属南通第三医院，江苏 南通 226006； 2.南通大学，江苏 南通 226006）

糖尿病肾病是糖尿病患者容易发生的并发症之一，是发展为终末期肾病的主要病因，也是糖尿病患者致死的重要原因之一，大约有30%～45% 的糖尿病患者会出现糖尿病肾病［1-2］。糖尿病肾病在临床上缺少有效的治疗方法，至今为止，其发病机制尚不清楚。中药单体在糖尿病肾病的治疗中发挥一定作用，如姜黄素、丹酚酸B 等［3-6］。大黄蒽醌类化合物大黄酸在降血糖、抗氧化、抗炎、抗癌等方面有重要作用［7-8］。大黄酸已被证实可通过TGF-β1／Smad信号转导途径对糖尿病肾病大鼠肾脏发挥保护作用［9］，本研究基于PI3K／Akt／FoxO1 信号转导通路，通过构建STZ 诱导的2 型糖尿病大鼠模型，从氧化应激指标、肾组织病理形态学及目标蛋白表达等情况，进一步探讨大黄酸对糖尿病肾病大鼠肾脏的保护作用。

1 材料

1.1 试剂与药物 大黄酸购自上海笛柏生物科技有限公司，纯度＞98.0%，批号DK05，用含0.5%羟甲基纤维素钠（CMC）的0.9%NaCl 溶液配置成相应剂量的混悬液；阳性对照药二甲双胍购自上海信宜天平药业有限公司，批号67100507。链脲佐菌素（STZ）购自美国Sigma 公司，临用前用0.1 mol／L 柠檬酸缓冲液配置成1% 溶液；丙二醛（MDA）试剂盒、超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）试剂盒购自南京建成生物工程研究所；β-actin 抗体购自上海康成生物工程有限公司；PI3K、Akt、FoxO1 抗体购自美国CST 公司；预染蛋白Marker 购自美国New England Biolabs 公司；蛋白浓度测定试剂盒购自海门碧云天生物技术有限公司。

1.2 仪器 One Touch 血糖仪（美国强生公司）；BH-NICB 型倒置显微镜（日本Olympus 公司）；蛋白电泳仪（美国Bio-Rad 公司）；SH-100 型凝胶图像分析仪（上海复旦高技术公司）。

1.3 动物 成年SD 大鼠70 只，雌雄各半，体质量160～180 g，饲养于南通大学实验动物中心，实验动物生产许可证号SCXK（苏）2018-001，分笼饲养，每笼4 只，环境温度24～26 ℃，相对湿度55%～60%，饲料与水充足。

2 方法

2.1 造模、分组与给药 随机取10 只大鼠为正常组，其余60 只为造模组。正常组大鼠给予普通饲料，造模组大鼠先给予高脂饮食（普通饲料70%、蛋黄粉5%、奶粉5%、脂肪20%）4 周后，在其胰岛素抵抗后禁食12 h，给予小剂量STZ（35 mg／kg）腹腔注射。1 周后，大鼠空腹血糖值大于11.1 mmol／L，提示造模成功。取48 只造模成功的大鼠随机分为模型组，大黄酸高、低剂量组（150、75 mg／kg），二甲双胍组（300 mg／kg），每组12 只，继续给予高脂饮食，每天给药1 次，正常组与模型组大鼠给予0.9%NaCl 灌胃，持续12 周。

2.2 血糖测定 给药12 周末，各组大鼠禁食12～14 h 后经尾静脉取血测空腹血糖。

2.3 体质量与肾脏指数测定 给药12 周末，取肾脏，用0.9%NaCl 溶液冲洗，滤纸吸干，称重并计算肾脏指数，肾脏指数＝双侧肾脏质量／大鼠体质量×100%。

2.4 肾组织MDA 水平和SOD、GSH-Px 活性检测 按照试剂盒说明检测各组大鼠肾脏组织中MDA 水平和SOD、GSH-Px 活性。

2.5 肾组织病理形态学观察 取肾脏置于4%多聚甲醛中固定24 h，石蜡包埋，切片，行HE 与Masson 染色，通过光镜观察肾组织病理形态学变化，拍照，每只大鼠选取5个典型视野进行统计分析，以系膜基质百分比为依据进行肾小球损伤评分。

2.6 免疫组化法检测FoxO1 蛋白表达 组织切片后进行脱蜡，使用柠檬酸缓冲液进行抗原修复，3% 双氧水灭活，FoxO1（1∶200）4 ℃孵育过夜，37 ℃复温30 min，PBS 洗涤，二抗（1∶1 000）37 ℃孵育30 min，洗涤，DAB 显色，苏木素复染，透明，封片，采用JEDA801D 型形态学软件测定阳性信号的面积与平均灰度。

2.7 Western blot 法检测PI3K、Akt 与FoxO1 蛋白表达取100 mg 肾组织，组织裂解液提取蛋白，BCA 法进行蛋白定量。用8% SDS-PAGE 凝胶电泳分离蛋白，随后转移至PVDF 膜上，置于5%脱脂牛奶TBST 溶液中室温封闭2 h，分别加入一抗与β-actin 抗体4 ℃摇床孵育过夜，TBST 洗涤2 次，加二抗室温反应1 h，TBST 洗涤2 次后于暗室加入ECL 试剂，X 线胶片曝光显影定影，测定各组蛋白与内参（β-actin）条带灰度值的比值，取平均值。

2.8 统计学分析 通过SPSS 20.0 软件进行处理，计量资料以（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 各组大鼠空腹血糖变化 与正常组比较，模型组大鼠空腹血糖升高（P＜0.05）；与模型组比较，大黄酸高剂量组与二甲双胍组大鼠空腹血糖降低（P＜0.05），见表1。

表1 各组大鼠空腹血糖比较（±s）

表1 各组大鼠空腹血糖比较（±s）

注：与正常组比较，**P＜0.01；与模型组比较，＃P＜0.05。

3.2 各组大鼠一般状态、体质量与肾脏指数变化 正常组大鼠活动状态良好，行动灵敏，外表毛发整齐；模型组与大黄酸低剂量组大鼠多数安静不动，外表毛发脏乱；大黄酸高剂量组与二甲双胍组大鼠活动状态良好，行动灵敏，毛发色泽较光亮。与正常组比较，模型组大鼠体质量下降，肾脏指数升高（P＜0.05）；与模型组比较，大黄酸高剂量组与二甲双胍组大鼠体质量升高，肾脏指数下降（P＜0.05），见表2。

表2 各组大鼠体质量与肾脏指数比较（±s）

表2 各组大鼠体质量与肾脏指数比较（±s）

注：与正常组比较，*P＜0.05；与模型组比较，＃P＜0.05。

3.3 各组大鼠肾脏MDA 水平和SOD、GSH-Px 活性变化与正常组比较，模型组大鼠肾脏组织MDA 水平升高，SOD、GSH-Px 活性降低（P＜0.01）；与模型组比较，大黄酸各剂量组与二甲双胍组大鼠肾组织MDA 水平降低，SOD、GSH-Px 活性升高（P＜0.05，P＜0.01），见表3。

表3 各组大鼠肾脏MDA 水平和SOD、GSH-Px 活性比较（±s）

表3 各组大鼠肾脏MDA 水平和SOD、GSH-Px 活性比较（±s）

注：与正常组比较，**P＜0.01；与模型组比较，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

3.4 各组大鼠肾组织病理形态学变化 肉眼观察正常组大鼠肾脏表面颜色为暗红色，包膜清晰易剥离；模型组大鼠肾脏体积较大，颜色较正常组苍白；其余给药组大鼠肾脏外观性状介于正常组与模型组之间。HE 染色显示，正常组大鼠肾脏结构清晰，间质无炎症细胞浸润；模型组大鼠肾组织增生明显，细胞外基质增多；各给药组大鼠上述病变均有不同程度改善，部分肾小球增大、系膜细胞增生等均可见不同程度改善。通过肾小球损伤指数分析，与正常组比较，模型组大鼠肾组织损伤加重（P＜0.01）；与模型组比较，大黄酸各剂量组肾组织损伤减轻（P＜0.01），见图1～2、表4～5。

图1 各组大鼠肾脏HE 染色图（×100）

图2 各组大鼠肾脏Masson 染色图（×400）

表4 各组大鼠肾组织HE 染色肾小球损伤指数比较（±s）

表4 各组大鼠肾组织HE 染色肾小球损伤指数比较（±s）

注：与正常组比较，**P＜0.01；与模型组比较，＃＃P＜0.01。

表5 各组大鼠肾组织Masson 染色肾小球损伤指数比较（±s）

表5 各组大鼠肾组织Masson 染色肾小球损伤指数比较（±s）

注：与正常组比较，**P＜0.01；与模型组比较，＃＃P＜0.01。

3.5 各组大鼠肾组织FoxO1 蛋白表达变化 与正常组比较，模型组肾组织FoxO1 表达增多（P＜0.05）；与模型组比较，大黄酸高剂量组与二甲双胍组FoxO1 表达降低（P＜0.05），见图3、表6。

图3 各组大鼠肾组织FoxO1 蛋白免疫组化染色图（×400）

表6 各组大鼠肾组织FoxO1 蛋白表达比较（±s）

表6 各组大鼠肾组织FoxO1 蛋白表达比较（±s）

注：与正常组比较，**P＜0.01；与模型组比较，＃＃P＜0.01。

3.6 各组大鼠肾组织PI3K、Akt、FoxO1 蛋白表达变化与正常组比较，模型组大鼠肾组织PI3K、Akt 蛋白表达降低（P＜0.05），FoxO1 蛋白表达升高（P＜0.05）；与模型组比较，大黄酸高剂量组与二甲双胍组大鼠肾脏组织PI3K、Akt 蛋白表达升高（P＜0.05），FoxO1 蛋白表达降低（P＜0.05），见图4、表7。

表7 各组大鼠肾组织PI3K、Akt、FoxO1 蛋白表达比较（±s）

表7 各组大鼠肾组织PI3K、Akt、FoxO1 蛋白表达比较（±s）

注：与正常组比较，**P＜0.01；与模型组比较，＃＃P＜0.01。

图4 各组大鼠肾组织PI3K、Akt、FoxO1 蛋白条带图

4 讨论

糖尿病肾病是糖尿病人群较重要的并发症之一，慢性高血糖及肾小球滤过增高导致的蛋白尿是其主要的临床表现，严重者甚至引起肾衰竭，危及生命。微量白蛋白尿是诊断糖尿病肾病的标志［9］。中草药在糖尿病治疗中的运用逐年增多，在治疗由糖尿病引起的各种并发症方面有着独特的疗效。大黄酸对糖尿病大鼠的肾脏病变具有预防和保护作用［10-14］。本实验结果显示，模型组大鼠的高血糖状态直接影响了其肾脏的功能。氧化应激指标检测发现，模型组大鼠肾组织MDA 水平均升高，SOD 与GSH-Px 活性降低，提示模型大鼠肾脏可能处于氧化应激损伤的状态，导致肾脏损害。给药干预12 周后，大黄酸高剂量组肾脏组织MDA水平降低，SOD 与GSH-Px 活性升高，提示大黄酸可减轻糖尿病对肾脏带来的损害。

PI3K／Akt／FoxO1 信号转导通路是胰岛素信号转导的主要途径，是生物体内调控血糖的主要信号转导通路［15］，其通过减轻高脂、高能量饮食带来的胰岛素抵抗，促进外周组织对葡萄糖的摄取。FoxO1 为一种多功能的蛋白，它是Forkhead 大家族中的一个蛋白亚群，在胰腺β 细胞与肝细胞中均有表达。FoxO1 可以抑制α 细胞向β 细胞转化，保护β 细胞免受氧化应激损伤，维持β 细胞终末分化状态以及抑制胰腺祖细胞分化为β 细胞［16］。Akt 是胰岛素信号传导途径中一个重要的下游分子，活化状态的Akt 可促进机体葡萄糖转运与糖原合成，提高机体对胰岛素的敏感，发挥降糖作用。同时，活化的Akt 使FoxO1 磷酸化而失去活性，降低糖异生基因G6P 及PEPCK 水平，从而减少糖异生，使血糖降低［17］。当2 型糖尿病患者体内胰岛素受体表达降低，干扰PI3K 活化，间接影响Akt 的活化，出现血糖升高。当PI3K／Akt／FoxO1 信号通路上任何一个因子代谢出现异常均可导致体内的胰岛素抵抗，极有可能诱发2 型糖尿病［18-19］。通过肾组织病理形态学观察，模型组大鼠肾组织增生明显，细胞外基质增多；而各给药组大鼠肾小球增大、肾小球系膜细胞增生等病变有所改善，其中以大黄酸高剂量组最为明显。大黄酸高剂量组与二甲双胍组大鼠肾脏组织PI3K 与Akt 表达升高，FoxO1 表达降低，表明其可能通过干预肾脏PI3K／Akt／FoxO1 信号转导通路，降低血糖，保护肾脏。