基于网络药理学探讨柴胡干预帕金森病的作用机制

徐水婷，胡玉英

1 广西中医药大学第一临床医学院，广西南宁 530001；2 广西中医药大学第一附属医院脑病科，广西南宁 530023

帕金森病（PD）是一种常见于中老年人的中枢神经系统变性疾病，临床典型的四大主症包括静止性震颤、运动迟缓、肌强直及姿势平衡障碍。目前PD的发病机制尚不明确，研究表明其与氧化应激、线粒体功能障碍、免疫炎性异常等诸多因素有关［1-2］。目前左旋多巴仍是治疗PD的金标准，但随着用药时间延长，药效逐渐减弱，且伴随出现各种不良反应及并发症。传统中药柴胡具有明显疏肝解郁之功效。PD的临床治疗中，以柴胡为主的中药复方应用广泛。现代药理学表明，柴胡可有效降低促炎性细胞因子的表达［3］，影响神经递质的产生，抑制蛋白沉积，调节细胞凋亡通路，减轻氧化应激反应等［4-6］。目前对于柴胡干预PD的药理学机制的研究相对较少。而网络药理学基于“疾病—基因—靶点—药物”相互作用网络，综合观察药物对疾病网络的干预与影响，从而系统、整体地探索药物与机体的相互作用［7］。本研究则通过网络药理学方法，从化学成分、作用靶点和信号传导通路等方面进行系统研究，进一步揭示柴胡的药理作用机制，并为PD的中药治疗提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 柴胡有效成分筛选及相关靶点预测 在中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）搜索“柴胡”的化学成分，按照“口服生物利用度（OB）≥30%，药物类药性（DL）≥0.18”条件筛选出柴胡有效成分，然后保存相关靶点，并通过ChemMapper网站补充柴胡成分靶点信息。利用UniProt数据库对柴胡有效成分的相关靶点进行基因注释。

1.2 柴胡—PD共同靶点收集及网络关系图构建 以“Parkinson's disease”作为关键词，检索人类基因数据库（GeneCards）和在线人类孟德尔遗传数据库（OMIM），整合去重后得到PD的疾病靶点。运用在线软件Venny 2.1.0对获得的柴胡成分靶点和PD疾病靶点进行分析处理，最终得到柴胡与PD的共同靶点。利用Cytoscape软件构建柴胡—PD共同靶点的网络关系图。

1.3 柴胡—PD蛋白相互作用（PPI）网络构建 将柴胡—PD共同靶点带入STRING网站，选择homo sapiens种属，构建PPI网络图。下载并保存PPI网络中的tsv文件，运用Cytoscape的CentiScaPe插件进行PPI网络拓扑分析，以连接度（Degree）≥62最终筛选出核心靶点。

1.4 柴胡—PD共同靶点GO分析及KEGG通路富集分析 将柴胡—PD共同靶点导入已安装Bioconductor、ClusterProfiler、ggplot程 序包及相关附加包的Rstudio软件中进行GO功能富集分析及KEGG通路富集分析，包括GO分析的生物过程（BP）、细胞成分（CC）和分子功能（MF）以及KEGG通路。按照P≤0.01且从小到大排序，选取前20位GO分析和KEGG通路富集分析结果，并对分析结果进行可视化构建。

1.5 KEGG通路关系网络构建 从得到的KEGG通路数据中选取富集最显著的前20位，运用Cytoscape软件构建网络图。计算出网络中各个节点的Degree值，调整节点的大小，以表示靶点与通路的相关性大小。

2 结果

2.1 柴胡有效成分及相关靶点 通过TCMSP数据库共筛选出柴胡有效成分17个。见表1。通过ChemMapper网站补充柴胡有效成分的相关靶点，整理去重后共得到746个潜在靶点。

表1 柴胡17个有效成分基本信息

2.2 柴胡—PD共同靶点及网络关系图 在Gene-Cards数据库中得到PD相关靶点7 232个，选择相关度得分≥13.01的靶点作为PD的潜在靶点，共获得907个。结合OMIM数据库补充相关靶点，去重后得到1 809个PD相关靶点。将柴胡有效成分的746个靶点与1 809个PD相关靶点取交集，通过在线软件Venny 2.1.0绘制韦恩图，获得172个共同靶点，见图1。利用Cytoscape软件构建柴胡—PD共同靶点的可视化网络关系图，见图2。

图1 柴胡—PD共同靶点韦恩图

图2 柴胡—PD共同靶点的网络关系图

2.3 柴胡—PD共同靶点PPI网络及核心靶点 在STRING网站中导入柴胡—PD的172个共同靶点后，得到柴胡—PD共同靶点PPI网络，见图3。使用Cytoscape中CentiScaPe插件进行拓扑结构分析，以Degree值≥62最终筛选出28个核心靶点，其中AKT1、INS、TNF、CASP3、IL6、TP53、VEGFA等为主要核心靶点，见图4。

图3 柴胡—PD共同靶点蛋白相互作用网络图

图4 柴胡—PD核心靶点图

2.4 柴胡—PD共同靶点GO功能及KEGG通路富集分析结果 将柴胡—PD共同靶点导入Rstudio软件中进行GO功能富集分析及KEGG通路富集分析，以P值＜0.01为筛选条件，得到439条GO生物学过程，159条KEGG通路。再利用R软件进行GO条形图以及KEGG气泡图的绘制，见图5、6。图5分别给出前20条BP、CC、MF富集分析结果，表明柴胡干预PD主要涉及基因表达、MAP激酶活性的正调控、老化、凋亡、细胞增殖等生物过程，细胞外间隙、膜筏、线粒体、高分子配合物、质膜等细胞成分以及相同的蛋白结合、酶结合、蛋白质酪氨酸激酶活性、大分子复杂结合、血红素结合等分子功能。图6显示了柴胡干预PD排名前20的信号通路，包括癌症通路、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、脂质和动脉粥样硬化、流体剪切应力和动脉粥样硬化、HIF-1信号通路等。

图5 GO功能富集分析结果图

图6 KEGG通路富集分析结果图

2.5 KEGG通路关系网络图 从得到的KEGG通路数据中选取富集最显著的前20位构建KEGG通路关系网络，见图7。

图7 KEGG通路关系网络图

3 讨论

PD属中医学“颤病”等范畴，按运动症状主要分为震颤型和僵直少动型，前者多为肝肾亏虚、肝风内动，治宜补益肝肾、平肝熄风；后者多为肝肾亏虚、筋失濡养，治宜补益肝肾、养血柔筋［8］。由此可知，肝肾亏虚是PD的重要病机。肝以气为用，以血为本，若肝失所养，肝风内动，可致震颤［9］。中医脏腑理论认为，肝胆相表里，且肝胆两经相互络属，在生理和病理上有着密切的联系。肝主疏泄，胆主通降，胆汁的正常排泄依靠肝的疏泄功能，肝胆合病终属“少阳病”范畴。临床发现从“和解少阳”治疗PD，能改善患者症状，疗效明显［10］。

中药柴胡历史悠久，味苦、辛，性微寒，归肝胆经，具有和解少阳之功，是治疗少阳证的首选药材。中医认为，PD脏腑定位主在肝，治疗方药以柴胡剂为主，取其君药柴胡和解少阳、调畅气机之效。现代药理研究表明，柴胡皂苷通过抑制炎症及氧化应激反应，具有显著的保肝作用，这也是柴胡发挥“引药

入肝”药性的物质基础［11-13］。本研究发现，乙酸芳樟酯、黄芩苷、茵陈黄酮、山柰酚、柴胡皂苷、槲皮素、豆甾醇等为柴胡主要有效成分。目前研究较多的众多黄酮类成分中，山柰素是一种很强的活性氧自由基清除剂，具有抗氧化作用［14］，槲皮素也可通过降低氧化产物的水平，减轻纹状体的炎症及氧化损伤。其他柴胡活性成分中，黄芩苷对过氧化脂质及氧化型谷胱甘肽形成均有抑制作用，能够增强超氧化物歧化酶、过氧化氢酶的活性，进而改善氧化应激反应［15］。曲克芦丁可有效增强腺苷酸环化酶及乙酰胆碱酯酶的活性，从而促进神经元细胞的快速修复，维持神经细胞结构的完整性［16］。豆甾醇能通过大脑血流屏障，抑制氧化应激反应，提高线粒体跨膜电位和ATP量，从而减轻PD患者的神经元变性［17］等。这些有效成分可在某种程度上干预PD的发病机制。

本研究显示，GO富集分析结果主要涉及基因表达、MAP激酶活性的正调控、老化、凋亡、细胞增殖等生物过程。KEGG通路显著富集主要在脂质和动脉粥样硬化通路、流体剪切应力和动脉粥样硬化通路、HIF-1信号通路等。脂质参与了大多数经典的PD相关过程，例如氧化应激，但血脂水平与PD风险之间的因果关系尚未确定［18］。有研究认为，PD患者的动脉粥样硬化程度随着PD病程的进展逐渐减轻，可能是通过miR-106a-5p/ABCA1通路影响泡沫细胞胆固醇的逆转运而发挥作用［19］。HIF-1α作为最先发现的低氧诱导因子家族中蛋白因子，低氧时呈高表达，可精准反映细胞内氧分压水平，并对下游靶细胞进行调控，从而发挥神经保护作用［20］。除了前20条显著富集的通路外，共同靶点还富集在MAPK信号通路、PI3K/AKT信号通路、IL-17信号通路等与PD相关的信号通路上。MAPK是神经元凋亡的强效因子，其过度激活可导致PD神经元死亡［21］。p38 MAPK信号通路作为MAPK信号通路之一，其异常激活后能通过调控自噬参与PD进程［22］。另外，PTEN/PI3K/AKT轴可控制代谢、凋亡、细胞生长和增殖等多种生物信号传导过程，是一条调节机体功能的重要途径［23］，PI3K/AKT信号传导也是自噬的经典负调控途径［24］，通过上调miR-221靶向PTEN介导的PI3K/AKT信号通路来调节自噬，从而发挥对PD的保护作用［25］。炎症对PD神经退行性变的关键作用已得到充分证实。IL-17就是一种促炎因子。有研究表明，产生IL-17的T淋巴细胞通过IL-17R介导并导致下游的NF-κB激活［26］。NF-κB作为免疫反应的主要转录因子，过度的激活引发异常的炎症反应是导致PD患者多巴胺能神经元丢失的主要因素之一［27］。综上，柴胡中的活性成分可能通过上述通路，调节血脂水平、氧化应激、神经保护、凋亡、自噬、炎症反应等，从而发挥干预PD的作用。

本研究PPI网络核心靶点和及KEGG关系网络分析显示，柴胡可能通过AKT1、INS、TNF、CASP3、IL-6、TP53、VEGFA等靶点发挥治疗作用。AKT又称蛋白激酶B，AKT1作为其亚型之一，通过调控转录发挥作用，其活性减低与PD的发病密切相关［28］。TNF、IL-6均是典型的炎性细胞因子。PD的发病过程涉及神经系统炎症反应和多种免疫应激反应，与血清TNF-α及IL-6等水平的变化有密切联系［29］。其中，TNF分型TNF-α是由单核细胞和淋巴细胞产生的重要炎症介质，参与机体免疫反应［30］，通过诱发氧化应激反应，使活性氧堆积在纹状路，引起神经元凋亡，参与PD发病过程［31］。IL-6也是调控机体炎症反应和免疫应答较为重要的炎症因子之一［32］。CASP3是调控细胞凋亡过程的标志蛋白，细胞凋亡原本是细胞主动死亡的过程，在维持机体稳态方面发挥着非常重要的作用，但异常凋亡与PD的发展进程有关［33］。VEGF对PD具有治疗作用，主要是VEGF与VEGFR2结合后激活P13K/Akt及MEK/Erk途径减少神经细胞凋亡，通过一个独立的机制直接作用于神经细胞促进神经再生和恢复［34］。

综上，本研究基于网络药理学探讨柴胡干预PD的作用机制，结果表明，柴胡通过多成分、多靶点、多通路发挥作用，表明了多个生物学过程的介导和参与是中药发挥治疗作用的关键，也为本课题后期研究中药复方治疗PD的作用机制奠定了理论基础。

利益冲突所有作者声明不存在利益冲突

作者贡献声明徐水婷：论文撰写及文献资料的收集分析；胡玉英：论文审核及修正，指导写作