非洲猪瘟病毒CD2v胞内区蛋白间接ELISA方法的建立及初步应用

王新凯，杨芷翊，周华亮，唐金明，3，黄超华，曹琛福，贾伟新

（1.华南农业大学兽医学院，国家非洲猪瘟区域实验室（广州）/人兽共患病防控制剂国家地方联合工程实验室/农业农村部人畜共患病重点实验室/农业农村部兽用疫苗创制重点实验室/广东省动物源性人兽共患病防控重点实验室，广东广州 510642；2.深圳海关动植物检验检疫技术中心，广东深圳 518045；3.深圳市龙岗区吉华街道公共事务中心，广东深圳 518100）

非洲猪瘟（ASF）是由非洲猪瘟病毒（ASFV）引起的高度传染性疫病，所有年龄段的野猪和家猪对其均易感，其高死亡率和快速传播给全世界养猪生产造成巨大经济损失[1]。ASFV是一种较大的具有二十面体结构的双链DNA虫媒性囊膜病毒，是目前已知的唯一虫媒传播DNA病毒[2-3]。ASFVEP402R基因编码的CD2v蛋白是一种跨膜蛋白，具有N端信号肽和1个跨膜结构域，与宿主CD2蛋白有相似之处[4]。ASFV CD2v蛋白与宿主CD2蛋白共有2个IgSF结构域，包括1个缺乏常见二硫键的N末端V型结构域和1个膜近端C型结构域。CD2v蛋白是细胞外病毒粒子与红细胞结合所必需的物质，具有介导ASFV感染细胞周围出现红细胞吸附（HAD）的功能[5]。从分离毒株的基因组中删除EP402R基因，不会影响该病死亡率，但会延迟病毒血症的发生以及延长病毒传播到组织的过程[5]。

近年来，全球范围内出现了EP402R基因缺失的ASFV突变毒株，并已在我国流行[6-8]。在3 660份国内样本中分离出22株ASFV毒株，其中11株为CD2v蛋白未表达的低毒力自然突变株，占50%[6，8]。EP402R基因缺失是野生型ASFV突变株的主要特征，导致翻译的早期终止和移码突变，从而在感染的巨噬细胞中产生非血吸附表型[8]。先前的研究[6，8]发现，感染CD2v蛋白未表达的ASFV低毒力自然突变株的猪可以排出病毒，并表现出关节炎、皮肤坏死等病症，但缺乏野生型ASFV感染的典型临床症状。当使用世界动物卫生组织（WOAH）推荐的荧光定量PCR（qPCR）和ELISA方法检测时，在口腔、直肠和血液样本中很难区分出CD2v缺失株，这给ASF防控带来了更大挑战[8]。因此，需要开发一种检测方法来区分CD2v缺失的自然突变株和野生型ASFV毒株。

1 材料与方法

1.1 血清、表达质粒、菌株

重组表达质粒pET-28a-CD2v-IS，购自生工生物工程（上海）股份有限公司；BL21（DE3）感受态细胞，购自北京全式金生物技术有限公司；ASFV标准阳性血清、ASFV CD2v缺失株标准阳性血清，购自中国兽医药品监察所；ASFV、猪瘟病毒（CSFV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、O型口蹄疫病毒（FMDV-O）、猪圆环病毒2型（PCV2）等抗体阳性血清以及116份已知抗体检测结果的猪血清、54份未知抗体检测结果的猪血清（此前采集，未检测），均由华南农业大学人畜共患病实验室保存并提供。

1.2 主要试剂

LB培养基、LB琼脂培养基、卡那霉素、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、20×ELISA洗涤液、ELISA底物液、ELISA终止液，均购自生工生物工程（上海）股份有限公司；10×ELISA包被液，购自索莱宝公司；封闭液，购自Thermo公司；HIS单克隆抗体与辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗猪IgG，购自Abcam公司；HIS标签蛋白纯化试剂盒，购自碧云天公司；增强型HRPDAB显色液，购自TIANGEN公司。

1.3 CD2v蛋白生物信息学分析

从GenBank中下载WUHAN 2019-1株ASFVEP402R基因序列（登录号：MN393476.1），利用Hphob./Kyte &Doolittle法蛋白疏水性预测网站（https://web.expasy.org/protscale/），对CD2v蛋白编码基因全长亲水性进行分析，截取亲水性强的区域。

1.4 CD2v重组蛋白原核表达及纯化

1.4.1 CD2v重组表达质粒构建 将1.3中截取的CD2v蛋白氨基酸序列（232～333 aa），根据大肠杆菌密码子偏嗜性进行优化后，在pET-28a（+）表达载体的NcoI与XhoI酶切位点之间插入，构建出重组蛋白表达质粒pET-28a-CD2v-IS，委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.4.2 CD2v重组蛋白诱导表达与鉴定 将pET28a-CD2v-IS重组质粒转化到BL21（DE3）大肠杆菌感受态细胞，挑取单菌落接种于含有卡那霉素（50 μg/mL）的LB培养基中，37 ℃、220 r/min过夜培养；经菌液PCR鉴定验证成功转化后，按照1:100的比例接种于新的含有卡那霉素（50 μg/mL）的LB培养基中，37 ℃、220 r/min培养至OD600nm为0.6～0.8；加入IPTG使其终浓度为0.5 mmol/L，经16 ℃、220 r/min诱导表达20 h，收集菌体沉淀；经PBS洗涤后重悬，冰浴下超声破碎后，分别收集上清与沉淀制样，并设置未诱导组与pET-28a（+）空载体的阴性对照，进行SDSPAGE与Western-blot试验，分析重组蛋白表达情况与抗原性；按照上述蛋白表达条件大量诱导表达目的蛋白，收集菌体破碎后的上清液，用0.22 μm的滤膜过滤后，使用碧云天公司的HIS标签蛋白纯化试剂盒，参考其说明书对重组蛋白进行纯化。

1.5 基于CD2v重组蛋白间接ELISA方法的建立

1.5.1 最佳反应条件优化 将纯化后的蛋白分别使用1×包被液稀释成不同质量浓度（0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00 μg/mL），分3批进行包被，每个包被浓度做2个重复；4 ℃包被过夜后弃去抗原液，每孔使用300 μL的1×PBST洗涤1遍；每孔加入100 μL封闭液，37 ℃封闭1 h后弃去封闭液；每孔加入100 μL稀释过的ASFV阳性血清和阴性血清作为一抗，进行间接ELISA试验，以P/N最大值且标准方差最小对应值为最佳抗原蛋白包被浓度。根据已确定好的最佳包被浓度，分别对ASFV阴阳血清稀释倍数（2倍倍比稀释：1:5～1:160）、一抗孵育时间（30、60、90、120 min），山羊抗猪HRP-IgG稀释倍数（1:5 000、1:10 000、1:20 000、1:30 000、1:40 000），二抗孵育时间（15、30、45、60 min），底物孵育时间（2.5、5.0、7.5、10.0 min）进行优化；按照以上不同条件进行棋盘筛选，每种试剂均为100 μL/孔，每次更换试剂时均使用1×PBST洗涤3次，每次300 μL，确定间接ELISA方法的最佳反应条件。

1.5.2 临界值确定 用上述优化后的间接ELISA方法分别检测74份已知ASFV抗体阴性血清与42份已知ASFV抗体阳性血清，每份血清做两个重复，计算所有阴性血清OD450nm的平均值与变异系数（CV），以其平均值+3×CV的值除以平均值作为临界值，大于该临界值判定为阳性，小于该临界值判定为阴性。

1.5.3 特异性试验 选取ASFV（CD2v编码基因缺失）抗体阳性血清2份、PRV-gE抗体阳性血清4份与CSFV、PRRSV、FMDV-O、PCV2抗体阳性血清各5份，并设置ASFV阳性血清与阴性血清对照，采用本试验中优化的间接ELISA方法进行检测，以评价所建立ELISA方法的特异性。

1.5.4 敏感性试验 将ASFV标准阳性血清按 1:10～1:5 120进行倍比稀释，采用优化的间接ELISA方法，检测不同稀释倍数的标准阳性血清，以评价所建立ELISA方法的敏感性。

1.5.5 重复性试验 使用同一批次包被的酶标板检测4份血清，每份血清2个重复，以确定所建立ELISA方法的批内变异系数；使用不同批次包被的酶标板检测4份血清，每份血清2个重复，以确定所建立ELISA方法的批间变异系数。

1.5.6 符合性试验 用本研究建立的间接 ELISA 方法（方法A）、北京金诺百泰生物技术有限公司生产的ASFV抗体检测试剂盒（方法B）以及WOAH推荐的间接ELISA方法（方法C），同时对46份已知检测结果的血清与54份未知检测结果的临床样本进行检测，计算两者的符合率。

2 结果

2.1 CD2v编码基因生物信息学分析

2.1.1 CD2v蛋白疏水性分析 CD2v蛋白全长疏水性分析预测结果（图1）显示，CD2v蛋白胞内区亲水性强，适合进行上清表达。

图1 CD2v蛋白疏水性分析结果

2.1.2 CD2v编码基因优化后序列 对CD2v蛋白全长进行生物学分析后，选取亲水性强的232～333 aa所对应的基因，根据大肠杆菌密码子偏嗜性优化后的序列为，ATGCGTAAACGTAAA AAACACGTTGAAGAAATCGAAAGCCCGCCG CCGGAATCTAACGAAGAAGAACAGTGCCAG CACGATGATACCACCAGCATCCACGAACCGA GCCCGCGTGAACCGCTGCTGCCGAAACCGTA TAGCCGTTATCAGTATAACACCCCGATCTACT ACATGCGTCCGTCTACCCAGCCGCTGAACCC GTTCCCGCTGCCGAAACCGTGTCCGCCGCCG AAACCGTGCCCGCCGCCGAAACCATGCCCGC CACCGAAACCGTGCCCGAGCGCAGAATCTTA CTCTCCGCCGAAACCG。

2.2 CD2v重组蛋白原核表达

2.2.1 重组表达质粒鉴定 利用T7通用型引物对挑取的单菌落进行PCR鉴定，PCR产物经生工生物工程（广州）股份有限公司测序发现，ASFV CD2v蛋白胞内区基因序列扩增长度与预期一致（594 bp），插入位置及开放阅读框均准确无误，表明重组表达质粒构建成功。

2.2.2 CD2v重组蛋白诱导表达 取1.4.2中制备的蛋白进行SDS-PAGE与Western-blot试验发现：CD2v-IS重组蛋白主要以可溶性形式表达存在，相对分子质量约为15 ku，与预期大小一致（图2-A）；使用ASFV标准阳性血清作为一抗，HRP标记的山羊抗猪IgG作为二抗进行孵育，结果发现单一特异性条带，相对分子质量约为15 ku，与预期大小一致（图2-B），表明该重组蛋白抗原性良好。按照蛋白纯化试剂盒说明书纯化重组蛋白，利用SDS-PAGE分析其纯化效果，结果发现重组蛋白纯化后在15 kDa处有单一条带，纯化效果好，经测NanoDrop One微量核酸蛋白浓度测定仪测定质量浓度为31 μg/mL（图2-C）；将纯化后的蛋白用PBS稀释并加入10%的甘油，分装后于-80 ℃进行保存。

图2 CD2v-IS表达的SDS-PAGE（A）、Western-blot（B）及其纯化（C）的鉴定结果

2.3 基于CD2v重组蛋白的间接ELISA方法建立

2.3.1 最佳反应条件确定 通过对1.5.1中设置不同优化条件依次进行测定后，确定该间接ELISA方法最佳反应条件结果见表1。

表1 间接ELISA方法反应条件的优化结果

2.3.2 阴阳性临界值确定 利用优化的间接ELISA方法，对74份背景清晰的ASFV抗体阴性血清与42份背景清晰的ASFV抗体阳性血清进行间接ELISA检测，结果发现阴性血清OD450nm为0.132 5～0.455，阳性血清OD450nm为1.039～2.113（图3）。分析计算结果显示：74份阴性血清样本的OD450nm平均值为0.271，变异系数（CV）为0.072 6，由此确定阴、阳判定临界值为1.61。应用此临界值可以很好地对阴阳血清进行区分。

图3 阴阳血清的OD450nm分布范围

2.3.3 间接ELISA方法特异性试验 用建立的间接ELISA方法对ASFV（CD2v缺失）株、PRRSV、FMDV-O、PRV-gE、CSFV、PCV2抗 体阳性血清进行检测，结果发现6种病毒的抗体阳性血清S/N值均＜1.61（图4），均为阴性，表明该方法具有良好的特异性。

图4 特异性试验结果

2.3.4 间接ELISA方法敏感性试验 用建立的间接ELISA方法检测稀释不同倍数的ASFV标准阳性血清，每个稀释度做2个重复，结果发现非标准阳性血清稀释至1 280倍时，S/N仍大于1.61（图5），呈现阳性结果，说明该方法具有很好的敏感性。

图5 敏感性试验结果

2.3.5 间接ELISA方法重复性试验 根据1.5.6中所述试验步骤进行重复性试验，结果发现批间变异系数均小于9.84%，批内变异系数小于4.15%（表2），证明所建立的ELISA方法具有很好的批间与批内重复性。

表2 本研究建立的间接ELISA重复性试验结果

2.3.6 间接ELISA方法符合性试验 46份已知检测结果临床血清样本检测结果（表3）显示：3种方法的检测结果与已知样本检测结果完全符合，符合率为100%。54份未知检测结果的临床样品检测结果（表4）显示：利用方法A检测，全部为ASFV阴性样品；使用方法B检测出5份ASFV阳性样品、49份阴性样品；使用方法C检测出4份ASFV阳性样品、50份阴性样本。方法A与方法B、C的符合率分别为90.7%与92.6%。汇总100份临床血清样本的检测结果可知，本研究建立的ELISA方法与商品化试剂盒、WOAH推荐的间接ELISA方法的符合率分别为95.0%与96.0%，符合率较高。

表3 3种ELISA方法对已知临床样本检测结果对比

表4 3种ELISA方法对未知临床样本检测结果对比

3 讨论

ASFV的CD2v蛋白是一种高度糖基化外膜蛋白[9]，其抗原性目前未知。研究[10]表明，糖基化蛋白是禽网状内皮组织增生症病毒最重要的免疫原性抗原。因此，ASFV的糖基化CD2v蛋白可能在感染细胞中具有重要功能，推测作为抗原进行ELISA方法的建立是可行的；CD2v蛋白在ASFV感染期间也可能与宿主细胞的糖基化受体有关，重组CD2v蛋白可用于研究受体和配体之间的相互作用，但其过程需要进一步研究。ASFV通过CD2v蛋白在感染的巨噬细胞中表现出HAD活性，说明该蛋白的缺失可导致非HAD表型[11]。2017年葡萄牙出现的非HAD基因I型分离株以及欧洲出现的非HAD基因II型分离株[6-7]，均表现病毒毒力减弱现象。最近，缺失CD2v的ASFV毒株在我国也被检测到，导致非HAD表型[8]。ASFV CD2v缺失株可导致非致死性、亚急性或慢性疾病以及持续感染，并且存在排毒不规则、易造成病原大规模传播的特点，对于感染猪的口腔和直肠拭子很难基于病毒DNA使用WOAH推荐的qPCR方法进行鉴别检测[8]。本研究基于重组CD2v蛋白建立的ELISA方法结合WOAH推荐的ELISA方法，可用于区分ASFV野生型毒株和CD2v缺失毒株，如果此方法能用于实验室检测，将在ASF流行病学及诊断中发挥重要作用。

以CD2v重组蛋白作为包被抗原建立ELISA方法，国内已经展开相关研究。周晓慧等[12]通过原核表达CD2v抗原指数较高的部分蛋白并以此建立的间接ELISA方法，蒋志勇等[13]使用CHO-K1细胞真核表达出CD2v全长蛋白并以此建立的间接ELISA方法，均具有一定参考意义。本研究通过对CD2v蛋白内膜区域进行低成本、简单、快速、高产量原核表达及纯化，并且利用ASFV（CD2v）缺失株标准阳性血清进行了特异性试验，建立的ELISA方法更加完善。在进行抗原浓度包被时，为使抗原抗体能够充分结合，选择不同包被批次对背景清晰的ASFV野毒感染抗体阳性血清与田间阴性血清进行检测，旨在找出不同条件下进行抗原包被都能达到最佳检测效果的浓度。在符合性试验中，用于检测的已知样本皆背景清晰且采样于CD2v缺失株出现之前，所以本研究建立的ELISA方法能够表现出较好的符合性及特异性。对于本研究建立的ELISA方法与商品化试剂盒，对近期采集的临床样本检测的阴性结果不符现象，可能是由于CD2v蛋白免疫原性较低以及其抗体产生时间较晚导致无法检测出来[12-13]。但是在本研究中筛选的背景清晰的已知样本中，也有感染前中期发病症状并不明显的样本，但检测依然具有很高的阳性值。P30蛋白也属于病毒颗粒中含量较少的结构蛋白，与CD2v含量接近，却依然能够刺激机体产生较强的免疫应答[14]。所以这些样本是否因为CD2v蛋白本身的特殊性无法检测到，还需要进一步研究。最近的ASF流行病学调查显示，这些阴性样本中可能存在CD2v缺失株[8]，使得本研究建立的ELISA方法能够检测出较多的阴性样本。本研究使用的商品化间接ELISA抗体检测试剂盒的包被抗原为P30重组蛋白，而WOAH推荐使用的间接ELISA方法包被抗原为全病毒蛋白，即使是CD2v缺失株也能够被检测出来，导致两种方法出现多份血清样本检测结果的差异性。这在一定程度上证实了本研究建立的间接ELISA方法可以很好地检测出ASFV野毒感染样本，而无法检测出ASFV（CD2v）缺失株阳性血清，如果同时结合其他ASFV结构蛋白制成的ELISA检测试剂盒，可以确定是否为CD2v缺失株感染。

本研究前期预试验中使用TBST作为样品稀释液进行检测，发现一些阴性样本检测结果为弱阳性。为减少此种检测结果的出现，参考本实验室专利[15]对样品稀释液进行优化，使用不含有靶标抗原的大肠杆菌破碎上清液作为样品稀释液，将样品中的非特异性IgG在液相环境中消除，从而达到检测结果的准确性。在符合性试验中，由于多份样品处理不当导致溶血，在检测过程中将此类样品与正常样品进行分类检测，结果显示本研究建立的间接ELISA方法可以很好地避免阴性样本由于溶血而造成的假阳性结果，增加了检测结果的可信度。

4 结论

综上所述，本研究通过原核表达系统表达纯化了CD2v内膜重组蛋白，并以此蛋白作为包被抗原建立并优化了间接ELISA方法。该方法具有很好的特异性、敏感性和重复性，对ASFV（CD2v）缺失株、PRRSV、FMDV-O型、PRV-gE、CSFV、PCV2等常见的猪病抗体阳性血清均无交叉反应，可检测到稀释1 280倍的ASFV标准阳性血清样本，如果同时结合其他ASFV结构蛋白制成的ELISA检测试剂盒，可应用于ASFV野毒感染与CD2v缺失株感染的鉴别诊断。