3味山姜属中药黄酮类成分对胃溃疡寒证大鼠胃消化液分泌的影响及作用机制研究∗

陈俊其，秦华珍△，尹 优，何瑞坤，黄焕迪，戴庆玲，钟 贵，王 晨，黄燕琼

1 广西中医药大学，广西 南宁 530200； 2 广西中医药大学附属瑞康医院，广西 南宁 530000

胃溃疡寒证属于中医学“胃痛”“胃脘痛”范畴［1］。胃溃疡寒证成因主要为寒邪犯胃，阻滞气机，致胃脘部疼痛，胃气失和，胃部遇冷或受凉之后胃痛加重，遇暖则舒缓。我国古代医书便已有对胃溃疡寒证的描述，《景岳全书》载有：“胃疼者食滞、寒滞、气滞者最多，且食、寒可致气不顺”，《沈氏尊生书·胃痛》中亦有记载：“胃痛，邪干胃脘病也。”表明我国古代医学家认为寒邪犯胃，寒滞于胃，是胃溃疡寒证形成的主要原因，食生冷苦寒之品，或者因气温急剧变化，往往是寒邪客胃，形成胃溃疡寒证的直接因素。

高良姜、大高良姜、红豆蔻3味中药同属于山姜属中药，在我国拥有悠久的用药历史，3味山姜属中药都具有温中散寒、温胃止痛等功效。本课题前期研究表明，山姜属中药对胃溃疡寒证具有药效［2］。文献研究表明，黄酮类成分为山姜属中药活性成分之一［3-4］。本文通过制备3味山姜属黄酮类成分，以大鼠复制胃溃疡寒证模型，测量大鼠胃液量、胃酸pH值、胃蛋白酶活力及胃组织中胃动素（motilin，MTL）、胃泌素（gastrin，GAS）、生长抑制素（somatostatin，SS）及H+-K+-ATP酶活力，探讨3味山姜属中药黄酮类成分对胃溃疡寒证大鼠胃消化液的影响及作用机制。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂高良姜、大高良姜、红豆蔻（安国市冷背药材有限公司，批号：20181018，产地：广西）；干姜提取物（西安宝益丰生物科技有限公司，批号：20190912）；95%乙醇，盐酸，冰乙酸（西陇化工股份有限公司，批号：20190316、20190507、20190507）；氢氧化钠（上海麦克林生化科技有限公司，批号：C10492126）。

1.2 实验动物90只SPF级SD雄性大鼠，体质量180～220 g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，实验动物许可证号：SCXK（湘）2016-0002。饲养环境：温度：18±4℃，RH 50%±10，洁净级别：CV。

1.3 实验方法

1.3.1 药物制备

1.3.1.1 造模药物 冰知母水制备：取知母8 kg，加10倍量的纯水浸泡1 h，煮沸后保持微沸1 h，过滤，再加8倍量水煎40 min，过滤，合并2次滤液，加热浓缩至0.5 g/mL生药浓度，静置冷却，分装保存于4 ℃冰箱备用。冰乙酸溶液制备：取一定量的99.5%冰乙酸，加纯水稀释成15%冰乙酸溶液。

1.3.1.2 受试药物制备 取适量高良姜、大高良姜、红豆蔻中药饮片分别粉碎成粗粉，依次加入40倍量95%、60%乙醇，每次回流提取4 h，过滤，合并所得的滤液，减压浓缩，回收乙醇至无醇味。将粗提物加适量的水混匀，煮沸，加入1 moL/L氢氧化钠溶液调节pH值至10～11，煮沸1 h，过滤，重复2次，合并滤液，滤液加入1 moL/L盐酸溶液调节pH至1～2，水浴保温30 min，放置24 h，析出沉淀，离心，弃去上清液，沉淀用蒸馏水抽洗2～3次，40 ℃真空干燥，得到3味山姜属中药黄酮提取物，备用，用时以0.5%羧甲基纤维素钠溶液配成相应浓度。

1.3.1.3 阳性药物制备 以0.5%羧甲基纤维素钠将干姜姜辣素配置成相应浓度，备用。

1.3.2 药效实验

1.3.2.1 分组与造模 取90只SPF级SD大鼠，随机抽取10只大鼠为空白组，其余大鼠进行胃溃疡寒证造模，每天早上灌服冰知母水（剂量10.44 g/kg，生药量0.5 g/mL，给药量2 mL/100g，温度4 ℃），下午灌服15%冰乙酸水溶液1 mL，每天1次，连续4天。末次造模结束后随机分为模型组，干姜姜辣素组，高良姜高、低剂量组，大高良姜高、低剂量组，红豆蔻高、低剂量组，共9组。

1.3.2.2 给药方法 造模结束后第2天开始给药，空白组和模型组灌服0.5%羧甲基纤维素钠水溶液，阳性组灌服干姜提取物水溶液，受试药物高、低剂量组分别灌服相应样品，根据前期研究［5］，以黄酮得率为基础（高良姜黄酮得率为124.1 g/kg、高良姜黄酮得率为98.1 g/kg、红豆蔻黄酮得率为118.5 g/kg），给药剂量为临床用量的4倍与16倍，给药体积均为1 mL/100g，每隔12 h给药1次，共给药4次。

1.4 观察指标

1.4.1 大鼠胃液量、胃酸pH、胃蛋白酶胃液量测定：末次给药后，禁食不禁水12 h，以10%水合氯醛麻醉大鼠，剖开大鼠腹部，于贲门处用细线结扎，剪下全胃，倾出胃溶物于刻度容量管中，记录刻度值。胃液总酸度测定：将收集的胃液于离心半径：80 cm，1500 r/min离心15 min，取上清液1 mL，滴加1%酚酞指示剂3滴，0.1 moL/L的NaOH溶液滴定，至溶液转为红色并且2 s内不变色消失为终点，记录用去的NaOH溶液量，求出胃液总酸度。胃蛋白酶活力测定：取离心后上清胃液，采用ELISA试剂盒方法操作测定胃蛋白酶活力。

1.4.2 大鼠胃组织MTL、GAS、SS含量及H+-K+-ATP酶活力测定处死大鼠，沿腹腔剪开，剥离胃，沿胃大弯剪开，用生理盐水清洗去除食物残渣，剪取胃溃疡病灶及周围组织约1 g，加入冰生理盐水，制备10%组织匀浆，离心半径：80 cm，3000 r/min离心15 min，分取上清液，备用。参考试剂盒方法测定大鼠胃组织MTL、GAS、SS含量及H+-K+-ATP酶活力。

1.4.3 大鼠全身机能指标测定造模及给药期间，采用电子天平对大鼠体质量、进食量进行称量统计，采用量筒测量统计各组大鼠饮水量，采用电子体温计测定大鼠肛温，记录。

1.5 统计学方法采用SPSS 24.0进行统计学处理。计量数据以±s表示，组间比较采用两样本均数t检验，多组间样本均数比较采用方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠胃液量、胃酸pH、胃蛋白酶与空白组比较，模型组大鼠胃液量、胃蛋白酶活力显著增加（P＜0.01），胃酸pH值显著降低（P＜0.01）。与模型组比较，干姜姜辣素组，高良姜、大高良姜高低剂量组，红豆蔻高剂量组大鼠胃液量显著减少（P＜0.01或P＜0.05），pH显著升高（P＜0.01或P＜0.05）；干姜姜辣素组，高良姜、大高良姜、红豆蔻高剂量组大鼠胃蛋白酶活力显著降低（P＜0.01或P＜0.05）。同剂量组间比较，高良姜与红豆蔻高剂量组胃酸pH有差异（P＜0.05），其他各组间胃液、胃酸pH值及胃蛋白酶活力均无统计学差异（P＞0.05）。见表1。

表1 各组大鼠胃液量、胃酸pH及胃蛋白酶比较（±s）

表1 各组大鼠胃液量、胃酸pH及胃蛋白酶比较（±s）

注：与空白组比较，∆∆表示P＜0.01；与模型组比较，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01（下同）

2.2 胃组织GAS、MTL、SS含量与空白组比较，模型组大鼠胃组织GAS、MTL含量显著增加（P＜0.01），SS含量显著减少（P＜0.01）。与模型组大鼠比较，干姜姜辣素组，高良姜高、低剂量组，大高良姜、红豆蔻高剂量组大鼠胃胃组织GAS含量，胃组织MTL含量显著减少（P＜0.01或P＜0.05），SS含量显著增加（P＜0.01或P＜0.05）。各给药同剂量组间比较，高良姜与大高良姜、红豆蔻高低剂量组间GAS含量差异有统计学意义（P＜0.01）；各给药组间MLT含量无统计学差异；红豆蔻高剂量组与高良姜、大高良姜高剂量组间SS含量有差异（P＜0.01）；高良姜低剂量组与大高良姜、红豆蔻低剂量组间SS含量有差异（P＜0.01）。见表2。

2.3 胃组织H+-K+-ATP酶活力与空白组大鼠比较，模型组大鼠胃组织H+-K+-ATP酶活力显著升高（P＜0.01），与模型组大鼠比较，干姜姜辣素组，高良姜高、低剂量组，大高良姜、红豆蔻高剂量组大鼠胃组织H+-K+-ATP酶活力显著降低（P＜0.01或P＜0.05）。各给药同剂量组间比较，高良姜高剂量组与红豆蔻、大高良姜低剂量组间间H+-K+-ATP酶活力有差异（P＜0.05）。见表2。

表2 各组大鼠胃组织GAS、MTL、SS含量及胃组织H+-K+-ATP酶活力比较（±s）

表2 各组大鼠胃组织GAS、MTL、SS含量及胃组织H+-K+-ATP酶活力比较（±s）

2.4 大鼠一般情况与空白组大鼠比较，模型组大鼠体质量显著减轻，日均进食量、饮水量显著减少（P＜0.01）。与模型组大鼠比较，干姜姜辣素组，高良姜、大高良姜高剂量组大鼠体质量、饮水量显著增加显著增加（P＜0.05）；干姜姜辣素组、大高良姜高剂量组、红豆蔻高低剂量组进食量显著增加（P＜0.01或P＜0.05）。见表3。

表3 各组大鼠体质量变化、进食量、饮水量及肛温的影响（±s）

表3 各组大鼠体质量变化、进食量、饮水量及肛温的影响（±s）

3 讨论

胃液的分泌是在中枢神经系统调节作用下，多种神经、体液与壁细胞参与的复杂过程。在胃溃疡形成的过程中，由于胃组织受损，对食物的消化能力降低，食物长时间潴留胃腔，对胃组织的刺激作用加强，胃液大量分泌，胃内离子浓度失衡，其负反馈调节作用无法正常进行，导致胃液不断分泌，造成胃部疼痛、食欲降低、胃部胀气等多种临床表现［6］。胃酸与胃蛋白酶是胃液的主要构成之一。胃酸具有调节胃腔酸碱度的功能。胃蛋白酶是由胃黏膜主细胞分泌的对食物进行消化的主要消化性蛋白酶，胃酸为胃蛋白酶活性提供了良好的酸性环境。研究表明，胃酸和胃蛋白酶在发挥消化食物作用的同时，也是胃溃疡的主要攻击因子之一。胃蛋白酶具有降解蛋白质分子的作用，能对胃黏膜上蛋白质分子进行降解，使胃黏膜受损。胃酸的大量分泌超过胃黏膜屏障的耐受程度，胃黏膜屏障被破坏，胃酸直接灼烧胃壁细胞，造成组织损伤，形成疮面，有学者认为胃酸-胃蛋白酶的自身消化作用是胃溃疡形成的最终因素。

本研究结果表明，在给药治疗后，3味山姜属中药高剂量组及高良姜、大高良姜低剂量组胃液量显著减少，胃酸pH显著升高。表明3味山姜属中药能够抑制胃酸分泌，提高胃酸碱度，改善胃内酸环境，同时降低胃蛋白酶的释放，减少胃蛋白酶活力，降低胃酸与胃蛋白酶的自消化作用，减少胃酸与胃蛋白酶对胃黏膜的攻击作用，促进胃黏膜愈合，减少食物对胃溃疡寒证大鼠机体的刺激性，减少胃液释放，改善大鼠消化功能。

胃肠激素是一类具有调节胃肠运动，促进消化液分泌的功能性多肽，主要与消化腺的分泌及消化道的运动有关。GAS又被称为促胃液素，其功能主要为促进胃黏膜细胞增殖，使胃及十二指肠黏膜肥厚，刺激胃壁细胞产生胃酸，并促进胃蛋白酶释放。GAS的异常分泌是造成胃溃疡的重要因素之一［7］。MTL是由Mo细胞分泌的一种22个氨基酸的直链多肽，主要分布于胃窦、十二指肠及小肠下段。MTL的分泌作用于胃肠平滑肌受体，增强胃肠平滑肌收缩，加速胃排空，刺激胃体小胃运动，促进胃蛋白酶分泌。研究表明，MTL释放对胃肠疾病有双向调节作用，适量的MTL释放能够促进胃肠道排空，加速食道消化，减少食物潴留，对治疗消化性疾病具有积极意义，而过量的MTL释放则使胃肠平滑肌收缩增强，胃蛋白酶分泌过量，产生胃黏膜血管紧张性收缩，胃血流量减少，胃黏膜细胞供血不足死亡，胃蛋白酶侵蚀胃黏膜细胞，形成溃疡性疾病。SS是一类由116个氨基酸大分子裂解形成的多肽，由胃窦、胃底及小肠黏膜内的D细胞所释放，SS在消化道中以胃窦和胃体中含量最高，具有抑制各种胃肠激素的分泌，抑制胃酸、胃蛋白酶等消化液、消化酶的分泌，降低胃肠运动等作用。

在胃溃疡形成的过程中，SS分泌降低，对胃肠激素GAS与MTL的抑制作用降低；GAS大量释放，促使胃壁细胞分泌胃酸；胃黏膜细胞产生胃蛋白酶；MTL大量释放，刺激胃肠运动加剧，胃肠平滑肌收缩增强，胃黏膜供血不足，导致胃黏膜屏障损伤，引发溃疡或减缓胃溃疡的愈合。

本研究结果表明，胃溃疡寒证模型组大鼠胃组织GAS、MTL含量显著增加，SS含量显著降低。表明在胃溃疡形成过程中，SS分泌受到抑制，对GAS和MTL的抑制作用降低，GAS和MTL的激动作用促使胃酸、胃蛋白酶分泌增多，胃组织活动增加，胃黏膜受到胃酸及胃蛋白酶的攻击，形成溃疡或加剧溃疡产生。在给药治疗后，3味山姜属中药黄酮类成分高剂量组及高良姜黄酮类成分低剂量组胃组织GAS含量显著减少，3味山姜属黄酮类成分高剂量组及高良姜黄酮类成分低剂量组大鼠胃组织MTL活力显著降低，表明3味山姜属中药黄酮类成分具有提高SS分泌，抑制GAS、MTL分泌的作用，它们通过平衡胃肠激素的含量，降低胃酸、胃蛋白酶的分泌，减少胃肠道活动，减少胃酸、胃蛋白酶对胃黏膜组织的攻击作用，促进溃疡面愈合。

H+-K+-ATP酶是一种镶嵌于膜内的转运蛋白，能够将胃黏膜细胞内合成的H+逆浓度差转移至细胞外，维持胃腔环境保持酸化，保持胃黏膜细胞内离子平衡。H+-K+-ATP酶与胃酸的形成直接相关，是壁细胞分泌胃酸的最后一个环节的关键酶，H+由H+-K+-ATP酶主动转运进入小管腔，与Cl-形成盐酸，再由胃壁细胞分泌至胃腔内，使胃腔形成酸环境，促进胃蛋白酶分泌并激活胃蛋白酶对食物对进行消化［8］。质子泵抑制剂是能够特异性干扰胃壁细胞的H+-K+-ATP酶活力的药物，能够通过血液运输，在胃壁细胞内与H+-K+-ATP酶共价结合，形成不可逆的分子性失活，是目前发现的抑制胃酸分泌作用最强并且最持久的一类药物。临床上常见的质子泵抑制剂有奥美拉唑、兰索拉唑等，这些药物对胃溃疡、胃壁泌酸等具有抑制作用［9］。多名学者临床观察表明通过中药联合质子泵抑制剂的治疗方法，能够起到促进胃溃疡愈合，同时降低西药质子泵抑制剂所产生的副作用，减少溃疡复发的作用［10］。

本研究结果表明，胃溃疡寒证模型组大鼠胃组织H+-K+-ATP酶活力显著增加，表明胃溃疡寒证大鼠胃壁细胞增殖、活动性增强，大量H+离子分泌进入胃腔内部，与Cl-形成胃酸并使胃内酸环境增强，胃黏膜屏障被破坏，产生胃溃疡。给药治疗后，3味山姜属中药黄酮类成分高剂量组及高良姜黄酮类成分低剂量组大鼠胃组织H+-K+-ATP酶活力显著提升，表明3味山姜属中药黄酮类成分具有H+-K+-ATP酶活力抑制作用，降低H+向胃内腔排放，减少胃酸分泌，降低胃酸对胃黏膜屏障的攻击作用，促使溃疡面愈合。