宽叶羌活和青海当归叶绿体全基因组序列比较分析和系统发育关系

谷 威 ，赵志敏 ，马永贵 ，2*

（1.青海师范大学 生命科学学院，青海 西宁 810008；2.青海师范大学 青海省青藏高原药用动植物资源重点实验室，青海 西宁 810008）

羌活（Notopterygium incisum）为伞形科植物羌活或宽叶羌活（Notopterygium franchetii）的干燥根茎及根，羌活属植物是分布在青藏高原及其邻近地区的中国特有多年生草本植物［1］。药理研究表明，羌活具有抗炎、抗菌、抗氧化等活性，且对心脑血管系统、消化系统、呼吸系统有显著影响［2］。青海当归（Angelica nitida）产于青海东南部、甘肃南部及四川北部，生长于海拔2 600～4 000 m的高山灌从、草甸、山谷等，是青藏高原特有种。作为中药材，青海当归根部代替当归治血虚、月经不调、头痛及关节炎，花常用于民间治头痛。

叶绿体基因组由一个环状DNA分子多个拷贝组成［3］，植物的叶绿体基因组具有四分体结构，包括一个大的单拷贝区域（Large single copy， LSC）、一个小的单拷贝区域（Small single copy， SSC）和一对反向重复序列（Inverted repeat， IR）［4］。在植物细胞中，相较于核基因组在基因的数量、大小、排序等方面存在较大差异，叶绿体基因组基因的数目、顺序相对保守且不易发生重组，保留了进化过程中的很多遗传信息，这使其在研究不同物种系统发育进化方面成为强有力的工具之一［5］。近年来，关于宽叶羌活、青海当归的研究相对集中于化学成分及药理活性的挖掘，而对其系统进化方面的研究相对较少，因此对两种青藏高原特有药用植物宽叶羌活和青海当归的叶绿体基因组进行研究，可有效补充植物界叶绿体基因组数据库，而对两种植物的基因组进行比较分析和系统发育分析，也有利于研究不同生物类群间的亲缘关系与进化命运，以期为研究植物系统发育关系提供参考。

1 材料与方法

1.1 样品采集

宽叶羌活和青海当归于2019年7月采于青海果洛藏族自治州班玛县的玛可河林场（东经：100°57′48.132″，北纬：32°50′13.4142″），用液氮将采集的新鲜叶片保存，回到实验室后保存于-80℃超低温冰箱中待用。

1.2 DNA提取、测序

宽叶羌活及青海当归用改良的CTAB法分离，用1%琼脂糖凝胶电泳和Nanodrop分光光度计检测已提取DNA的浓度、纯度，合格DNA经超声波片段化后进行PCR扩增，扩增后形成测序文库，用Illumina Novaseq平台（设置150 bp测序读长）进行测序［7］。

1.3 叶绿体基因组组装、注释及提交

测序后得到原始数据，过滤低质量值数据，使用MITObim软件［8］将其组装，之后再用Dual Organellar GenoMe Annotator（DOGMA，http：//dogma.ccbb.utexas.edu/）对 其 注释［9］，接 着 用 OGDRAW 软 件（http：//ogdraw.mpimp-golm.mpg.de/）绘制叶绿体基因组图谱，将注释后的序列信息提交至NCBI叶绿体基因组数据库得到：宽叶羌活（GenBank 登录号MW820162），青 海 当 归（GenBank 登 录 号MW820164）［10］。

1.4 SSR分析

宽叶羌活和青海当归叶绿体全基因组的简单重复序列（Simple sequence repeats， SSR）分析，使用MISA1.0软件，将参数设置成：单核苷酸为8，二核苷酸和三核苷酸都为4，四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸都为 3［11］。

1.5 系统发育关系分析

从NCBI的叶绿体数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/bro-wse/）下载伞形科：当归属福参（Angelica morii，MT921982-1），当归属东当归（Angelica acutiloba， KX352468-1），当归属大叶当归（Angelica megaphylla， MT921962-1），当归属狭叶当归（Angelica anomala， MT921977-1），当归属白芷（Angelica dahurica， MT921980-1），芹属旱芹（Apium graveolens， NC041087-1），明 党 参 属 明 党 参（Changium smyrnioides， MN092718-1），川明参属川明参（Chuanminshen violaceum， KU921430-2），糙果芹属细叶糙果芹（Trachyspermum ammi， NC047246-1），柴 胡 属 小 柴 胡（Bupleurum hamiltonii，MW262986-1），以十字花科南芥属硬毛南芥（Arabis hirsuta， AP009369-1）作为外类群，采用 MAFFT［12］软件进行多序列对比，然后用最大似然法（Maximum Likelihood，ML）对系统进化关系进行分析［13］，用PhyloSuite软件生成系统发育进化树。

2 结果与分析

2.1 叶绿体基因组结构特征

宽叶羌活和青海当归同属伞形科，叶绿体基因组的序列长度，结构都是相似的，如图1所示，两种植物都具有典型的四段式结构，由大单拷贝区、小单拷贝区、以及两个反向互补重复区组成。由表1可看出两种植物叶绿体基因组大小相差约5 kb，当归IR区序列长度较长（17 435bp），且LSC区较短（94 491bp），二者的叶绿体基因组长度在LSC区存在较大差异，GC含量差异较小。

表1 叶绿体基因组碱基组成Tab.1 Base composition of chloroplast genome

图1 叶绿体基因组图谱Fig.1 Chloroplast genome map

2.2 叶绿体基因组功能及分类

叶绿体基因组主要包含光合作用相关基因、遗传表达相关基因以及其他基因（表2），宽叶羌活和青海当归共有基因123、127个，其中蛋白编码基因80、83个，tRNA基因35、36个，rRNA基因8、8个，其中宽叶羌活相对于青海当归少了光系统II中的psbA基因及核糖体大亚基中的rpl16基因。

表2 叶绿体基因组基因信息分类Tab.2 Classification of chloroplast genome gene information

2.3 SSR分析

宽叶羌活、青海当归叶绿体基因组中共有208、219个SSR位点（表3），其中绝大部分SSR是单核苷酸重复，其次是二核苷酸重复，两种植物均有少量三核苷酸重复、四核苷酸重复及五核苷酸重复，其中青海当归中检测到一个六核苷酸重复序列。如表所示，两种植物SSR中的重复单元最多的都是A/T，其次是AT/AT、AG/CT、C/G等。

表3 叶绿体基因组中SSR类型及数量Tab.3 Types and numbers of SSRs in chloroplast genome

2.4 IR区边界分析

从NCBI上下载伞形科羌活属羌活（N. incisum，MW820162）的叶绿体基因组序列，将其与宽叶羌活、青海当归比较：从图2结果看出三种植物的基因ycf1均横跨了IRa区和SSC区，位于SSC区的片段长度从3 506bp（N. incisum）到3 601bp（A. nitida）不等。在青海当归和羌活中ndhF基因仅存在于SSC区一侧。

图2 叶绿体基因组IR区边界比较Fig.2 Comparison of IR region boundaries of chloroplast genome

2.5 亲缘关系分析

此次亲缘关系分析选取了在分类上与宽叶羌活、青海当归同为伞形科的10个物种：细叶糙果芹、旱芹、明党参、川明参、小柴胡、福参、东当归、大叶当归、狭叶当归、白芷，不同科的1个物种硬毛南芥，且以硬毛南芥叶绿体基因组作为外类群。从图3结果可看出，物种间科间关系明确，12个伞形科植物与十字花科植物硬毛南芥分属两支，青海当归与东当归、大叶当归、白芷、狭叶当归、福参同为当归属且聚成一支，自展值为100。宽叶羌活属羌活属，与当归属植物间支持率不高。当归属植物、宽叶羌活、旱芹、细叶糙果芹与川明参、明党参构成姐妹关系。

图3 基于宽叶羌活、青海当归和11个物种叶绿体全基因组构建的系统发育树Fig.3 Construction of phylogenetic tree of N. forbesii、A.nitida and 11 species based on chloroplast genome

3 讨 论

本研究对宽叶羌活和青海当归叶绿体全基因组进行分析，结果显示，两种植物均具有被子植物叶绿体基因组典型的环状四分体结构，两种植物叶绿体基因组编码的基因类别、数量高度相似，同时具有高度相似的G/C含量，其中，IR区序列的G/C含量最高，G/C含量从高到低依次为IR＞LSC＞SSC，研究表明，多种植物普遍存在IR区G/C含量最高的现象［14］，这与本文研究结果相一致。两种伞形科植物宽叶羌活和青海当归分别注释得到123、127个基因，大多数为参与光合作用过程的基因及起转录翻译作用的基因，这与多数植物叶绿体基因组中基因功能一致［15］。两种植物叶绿体基因组中的简单重复序列，由1～6个核苷酸组成［16］，SSRs大部分为单核苷酸，其中多为A/T，在青海当归中发现六核苷酸重复序列，而宽叶羌活没有，这与其它当归属植物一致［17］，SSR 的鉴定可以为两种青藏高原特有植物的遗传多样性提供基础研究。被子植物叶绿体基因组具有典型的环状四分体结构，这使得其存在4个边界，即LSC/IRb、IRb/SSC、SSC/IRa和IRa/LSC。在进化过程中，IR区常发生收缩或扩张现象，这也是造成被子植物不同类群叶绿体基因组长度差异的一个重要原因［18］，三种植物IRa/SSC区ycf1基因和IRb/SSC区ycf1假基因向SSC区扩张，大多数其他基因的位置与它们在其他叶绿体基因组中的位置相似［19，20］。为进一步确定伞形科在被子植物中的进化地位和亲缘关系，选取NCBI已公布的13种植物，以硬毛南芥作为外类群进行系统进化分析，结果显示各分支节点支持率较高，小柴胡位于进化树的基部，属伞形科中较为原始的类群，川明参

和明党参单独聚在一起，当归与当归属其余5个物种亲缘关系较近，且支持率较高，包括青海当归在内的当归属植物与宽叶羌活支持率不高，说明各植物科间关系明确。利用伞形科在内的13种植物叶绿体全基因组序列数据构建系统发育树，为伞形科植物近缘物种间的亲缘关系提供更多的系统发育数据。

4 总结

青海地处青藏高原，地形复杂多变，气候差异大，然而，独特的水热条件使得青海药用植物的药效优于其他地方，如羌活、党参、柴胡、虫草贝母等［21］。近些年随着国际市场对中药重视程度的提高，对于以当归为基础的复方制剂的研究日益增多，研究表明，当归具有增强人体免疫力、保护血管内皮、改善血液循环系统等疗效［22］，而青海当归在其原产地均作为当归入药［23］。宽叶羌活有较为悠久的开发历史，通常作为我国特有药用物种，且在保健品、药膳、茶饮等方面有着出色的表现力［24］。对药用植物的叶绿体基因组研究，有利于对物种遗传背景，药品鉴定及物种保护等方面进一步研究。而宽叶羌活和青海当归这两种伞形科植物，均有其潜在药用价值，对其研究可补充植物界叶绿体基因组数据库以及研究伞形科内部属间关系。