体外产气法评定不同蛋白饲料原料间的组合效应

卢哲丞， 张春桃， 成述儒， 屠 焰*

（1.甘肃农业大学动物科学技术学院，甘肃兰州 730070；2.中国农业科学院饲料研究所 奶牛营养学北京市重点实验室，北京 100081）

大豆粕作为目前我国畜禽饲料中应用最为广泛的植物性蛋白质饲料原料，每年消耗量很高，难以自给自足（郑祖庭，2019），致使大豆进口量逐渐攀升，进口依赖度居高不下。近年来受中美贸易摩擦及全球新冠大流行的影响，大豆及其副产品的国际贸易受阻，严重影响了我国的饲料行业（He等，2019）。大豆粕等饲料原料的价格波动不断，进一步增大了畜牧养殖成本，实施大豆减量计划已成为国家、农业农村部及行业重点关注的问题（薛俊敬等，2019）。充分利用非常规蛋白饲料资源（如菜籽粕、棉籽粕等）替代大豆粕，进而减少对大豆粕需求是大势所趋，但受抗营养因子的影响使得杂粕整体的营养性及适口性较差（Le等，2021；Yusuf等，2021），因此，用其替代大豆粕时应注意适宜的添加比例，以免影响畜禽的采食及健康。

体外产气法由Menke等（1988）所提出，是一种借助产气管等体外产气装置来模拟反刍动物瘤胃内部的发酵过程，并通过测定饲草料的体外发酵产气量，进而评定其营养价值的试验方法，相比传统的动物试验而言更为简便，且数据重复性更好，应用已十分广泛。我国在1983年开始在奶牛的相关研究上使用此方法 （丁角立等，1983）。Sallam等（2007）通过体外产气法验证了不同饲草料的体外产气量与其营养物质消化率的关系，进一步验证了通过体外产气试验证明饲草料营养价值的可行性。本研究针对饲料中杂粕替代大豆粕的现实问题，通过体外产气法评定了不同比例的菜籽粕、棉籽粕及大豆粕等蛋白饲料原料间的组合效应，提出杂粕替代大豆粕的适宜比例，为进一步开展的饲料大豆粕减量提供理论依据，减缓畜牧养殖成本及压力。

1 材料方法

1.1 试验材料 精料饲料原料为玉米、大豆粕、麸皮、菜籽粕、棉籽粕和干酒糟及其可溶物（DDGS），混以10%预混料；粗饲料原料为苜蓿和全株玉米青贮。所有饲料原料均购自内蒙古富川饲料科技股份有限公司，10%预混料购自北京精准动物营养研究中心有限公司。

1.2 试验日粮 本试验将精料和粗料按各自原料比例配制好后，再以精粗比为60：40混合配制成7种不同配方组合的饲粮，试验饲粮组成及原料营养水平见表1和表2。

表1 试验饲粮组成（干物质基础）

表2 饲粮原料营养水平（风干基础）%

1.3 试验动物及样品的采集 本试验于中国农业科学院南口中试基地开展。瘤胃液取自3头体重相近、健康无病且装有永久性瘘管的荷斯坦干奶牛，试验期3 d，每天饲喂全混合饲粮（TMR）两次（07：00、16：00），自由采食和饮水。于晨饲前1 h通过瘤胃瘘管采集瘤胃内容物，经4层纱布过滤至已预热的39℃保温瓶内迅速带回实验室，用于后续体外发酵。TMR组成及营养水平见表3。

表3 TMR组成及营养水平（干物质基础）

1.4 体外发酵 体外发酵采用DSHZ－300A水域恒温振荡器装置，称取约0.200 g组合饲粮样品于已涂抹凡士林的玻璃注射器内管中进行体外产气试验，每样品6个重复，每重复6支，并设置3支空白管。采用Menke法（1998）配制人工瘤胃液，并将人工瘤胃液与瘤胃液按体积比2：1混合，作为培养液。通入二氧化碳（CO2）排除空气，同时用分液器向培养管分装30.00 mL培养液，排除气泡，放置39℃恒温振荡培养箱中进行培养并开始计时。当培养至0、2、4、8、12、16、24、32、36、40、48、56、64 h及72 h时间点时，取培养管快速读取活塞所处的刻度值并记录。培养24 h后，每组各重复快速取3支培养管放入冰水浴中，发酵停止。将培养管中发酵液排出至对应编号的10.00 mL离心管中，用已校准的pH计测定pH并记录。发酵液经低温离心（4℃，8000g及15 min）后，取上清液冷冻保存，以备其他发酵参数［氨态氮（NH3-N）和微生物蛋白（MCP）产量］测定，每组各重复剩余的3支培养管至72 h时终止培养。

1.5 测定指标及方法

1.5.1 常规营养成分 测定的常规营养成分包括：干物质（DM），将粉碎风干后的样品至于105℃烘箱中烘干3 h后测定；粗灰分（Ash），将样品置于马弗炉内550℃灼烧8 h后测定；粗蛋白质（CP），采用FOSS DumatecTM-8000定氮仪测定；粗脂肪（EE），采用ANKOM-XT15i全自动脂肪分析仪测定；中性洗涤纤维（NDF）及酸性洗涤纤维（ADF），采用ANKOM-2000i全自动纤维分析仪测定；钙（Ca）和磷（P），采用FOSS NIRS DS-2500近红外分析仪测定。

1.5.2 体外累计净产气量的计算 净产气量的计算公式如下：

净产气量=某一时间段产气量-对应时间段内3支空白管的平均产气量。

1.5.3 体外产气动力学参数计算 记录底物在不同 时 间 点（0、2、4、8、12、16、24、32、36、40、48、56、64 h及72 h）的产气量，产气模型计算公式：Y=B（1-e-ct），式中：Y、B及c分别为t时间点0.200 g组合饲粮样本累积产气量、理论最大产气量及产气速度。

1.5.4 发酵液pH 采用经标准液校准的德图Testo 206 pH计测定体外发酵液的pH。

1.5.5 发酵液NH3-N的测定 应用屯妮萨（2012）的方法用碱性次氯酸钠-苯酚分光光度法测定发酵液中的NH3-N浓度。

1.5.6 微生物蛋白产量的测定 MCP产量的测定采用嘌呤法，利用酵母RNA做标准曲线，采用分光光度计测定其吸光度值，计算微生物蛋白质量浓度：

微生物蛋白氮=RNA测定值×RNA含氮量/细菌中RNA含氮量×稀释倍数；

微生物蛋白产量=微生物蛋白氮×6.25。

1.6 数据统计与分析 所有数据先采用Excel 2010进行初步整理得到净产气量，使用SAS 9.2处理软件NLIN（Nonlinear regression）程序计算B和c等发酵参数，采用单因素方差分析（One-way ANOVA）程序进行分析。差异显著性用Duncan氏法进行多重比较，P＜0.05表示差异显著，P＞0.05表示差异不显著。

2 结果

2.1 体外产气量 从表4可见，0～72 h各时间点的产气量总体呈递增趋势，但48～72 h时增速相对较慢，组合5除2 h和4 h外，其他各时间点的累计产气量均高于其他组（P＜0.05），2 h时产气量最高的为组合1，为17.50 mL，4 h时产气量最高的为组合4，为25.66 mL。组合6各时间点的累计产气量均低于其他组（P＜0.05），0～72 h各组合的累积产气量最大的是组合5，为70.67 mL（P＜0.05），最小的是组合6，为34.83 mL（P＜0.05），其他组合的产气量从多到少依次为组合4＞组合7＞组合2＞组合1＞组合3，产气量分别为66.67、64.17、63.03、48.17 mL和40.83 mL。

表4 体外发酵累计产气量mL

2.2 产气曲线 从图1可以看出，不同精粗料组合在各时间点产气量的动态变化，均呈产气加速度由慢到快，再到增速趋于0逐渐呈平缓的趋势。组合5较其他组合上升速度快之后趋于缓慢；其他组合于0～4 h产气量上升缓慢，4～48 h的体外产气量上升较快，之后趋于平缓。组合5产气速度最快且产量最大，其他组合的体外产气均有较长的延滞期。组合6的总产气量最少。

图1 体外产气曲线

2.3 体外产气动力学参数 由表5可见，底物的产气动力学参数与体外产气曲线相对应，各组的理论产气量与实际产气量相接近，组合5的理论产气量最大，为67.583 mL，其次是组合4、组合7和组合2，分别为63.950、62.810 mL和61.633 mL，四者差异不显著（P＞0.05）；但显著大于其他饲粮样品的理论产气量（P＜0.05），组合6的理论产气量最小，为39.013 mL（P＞0.05）；体外产气速度最快4个组合分别为组合5＞组合4＞组合2＞组合3，分别为0.105、0.103、0.093、0.092 mL/h，显著高于组合1和组合6（P＜0.05），组合6产气速度最慢，为0.053 mL/h（P＜0.05）。

表5 体外产气动力学参数

2.4 24 h发酵液发酵参数 由表6可见，24 h发酵液的pH为6.32～6.48，最高的4个组合依次为组合1＞组合7＞组合2＞组合6，四者差异不显著（P＞0.05），但显著高于其他组合（P＜0.05）；24 h发酵液的NH3-N浓度为19.11～33.17 mg/100 mL，组合3的发酵液NH3-N浓度为33.17 mg/100 mL，显著高于其他各组（P＜0.05），组合6最低，为19.11 mg/100 mL；各组24 h发酵液的MCP产量最高的为组合2，为1.04 mg/100 mL，组合6发酵液的MCP产量显著低于其他组合，为0.88 mg/100 mL（P＜0.05）。

表6 24 h发酵液发酵参数

3 讨论

3.1 体外产气量及产气曲线 体外发酵产气的来源主要是通过发酵液中的瘤胃细菌等微生物与底物（如碳水化合物）发酵产生的CO2、CH4等气体，体外产气量的高低不仅反映了饲草料的营养价值，同时也反映了微生物的活力及对营养物质的利用率（金恩望等，2012）。从体外产气曲线可看出，本试验中各组合饲粮的体外产期量均经历了增加速度由慢到快，再到增速趋于0逐渐呈平缓的趋势，这与李文娟等（2016）对5种甘蔗副产物所测定的体外产气趋势相一致。其主要原因可能是发酵初期微生物主要与饲草料植物细胞的细胞壁发生反应，而细胞壁中的糖类等碳水化合物含量较少且分解速度较慢，进而导致产气量及产气速度较慢，后期与含糖量较高的细胞液进行发酵反应从而使得产气量提升加快（赵庆新和袁生，2007）。孟梅娟（2015）通过研究不同非常规饲料资源组合的体外瘤胃体外发酵特性发现，各组的产气量与其有机物的含量呈正相关，本研究的结果与其基本一致。周玲等（2017）通过体外产气法评定空心菜、木薯杆等6种饲草料的营养价值发现，各草料的产气量与其消化率及营养价值等呈正相关，产气量越高的草料其相对饲用价值越高，而本试验在保证饲粮精粗比为60：40的情况下，产气量最高的饲粮组合为玉米∶麸皮∶棉籽粕∶菜籽粕∶DDGS=60∶15∶5∶5∶5，苜蓿：全株玉米青贮=10∶30，这说明饲粮中使用适量的棉籽粕、菜籽粕及DDGS代替的大豆粕后仍具有一定的饲喂价值。

3.2 体外产气动力学参数 本试验中所有组合饲料样本的72 h实际产气量与理论产气量基本一致。Nsahlai等（1994）通过体外产气法评定田菁的营养价值发现，其理论产气量与中性洗涤纤维、半纤维素及木质素的含量呈负相关，其原因是纤维、木质素等结构较为致密，会影响糖类等营养物质的释放，本试验的研究结果与其基本一致。汤少勋等（2006）将体外产气法进行一定的改进后，利用其评定了10种牧草的体外产气特性发现，各牧草的累计产气量及理论产气量与牧草中CP的含量均呈负相关关系，本试验中玉米∶麸皮∶大豆粕∶棉籽粕∶菜籽粕=60∶15∶5∶5∶5，苜蓿：全株玉米青贮=10∶30组合饲粮的累计产气量及理论产气量均为最低，且该组合中的大豆粕、菜籽粕及棉籽粕的CP含量均高于DDGS，饲粮整体CP含量也较高，验证了此结论。

3.3 体外发酵参数 酸度是瘤胃发酵参数的重要指标之一，与动物采食饲粮的类型、瘤胃的健康状况及其中VFA、NH3-H的浓度等均有一定关系。瘤胃中的pH对维持瘤胃内环境稳定起到至关重要的作用，pH过低会造成动物瘤胃酸中毒，过高则会降低瘤胃微生物的活性，影响营养物质的消化及吸收（尹梦洁，2021）。Rodrigues等（2020）研究表明，瘤胃微生物最适宜的pH为6.1～7.2，而本试验各组和饲粮的体外发酵pH均在6.3～6.5，说明各组合饲粮进入瘤胃后均未对瘤胃内环境产生不良影响。同时有研究表明，反刍动物瘤胃中的pH与其采食饲粮的纤维含量呈一定正相关关系（王海荣等，2008），这与本试验的结果有一定差异，本试验中pH最高的饲粮组合为不含杂粕的单一大豆粕组，且大豆粕的纤维含量要低于菜籽粕及棉籽粕，但瘤胃中的pH受到试验动物、饲粮、饮水及瘤胃中的VFA、NH3-H浓度等多种因素的共同影响，对此有待进一步研究证实。

NH3-H浓度是反映反刍动物瘤胃中氮代谢程度的重要指标，瘤胃微生物合成蛋白质的主要氮源就是NH3-H（焦光月等，2015），但NH3-H浓度若过高不仅是对养分的一种浪费，同时也会造成瘤胃内环境的pH偏高，不利于瘤胃微生物的生长及繁殖。研究表明瘤胃中NH3-H的浓度范围为7～34 mg/dL（Illius，1989），本试验中各组合饲粮体外瘤胃发酵液的NH3-H浓度均在此范围内。李金辉等（2022）研究表明，使用一定比例的棉籽粕替代饲粮中的大豆粕进行体外发酵后，发酵液的NH3-H浓度有所升高，而本试验中单一大豆粕组饲粮相比于添加棉籽粕饲粮的NH3-H浓度偏低，与该研究结果相一致，这可能与棉籽粕中的棉酚等物质限制了瘤胃微生物对NH3-H的降解及利用有一定关系。MCP是反刍动物机体每日消耗蛋白质的重要供应源，其质量浓度可以反映瘤胃中NH3-H的分解及利用程度，同时也一定程度的反映了瘤胃中细菌等微生物的种群多样性及大小（于锦皓等，2018）。本试验在保证精粗比为60∶40的情况下，除玉米∶麸皮∶大豆粕∶棉籽粕∶菜籽粕=60∶15∶5∶5∶5，苜蓿：全株青贮玉米=10∶30该组合饲粮体外瘤胃发酵液的MCP质量浓度显著低于其他各组外，其余各组间差异均不显著，说明该组的体外瘤胃发酵液中的微生物种群较小，其他无明显差异。

4 结论

在本试验条件下，不同组合比例的粗料代替豆粕体外发酵72 h时，玉米∶麸皮∶棉籽粕∶菜籽粕∶DDGS=60∶15∶5∶5∶5，苜蓿：全株青贮玉米=10∶30时组合效果最佳，可有效提高其营养成分的互补、瘤胃发酵水平，但其具体营养价值还需要通过动物试验进行验证。