质谱鉴定联合直接快速药敏试验在细菌血流感染中的应用

张小云，刘 本，连建春，姜玉章，唐朝贵，王 霞

（南京医科大学附属淮安一院检验科，江苏 淮安 223300）

血流感染（blood stream infection，BSI）是临床常见的严重感染性疾病，具有起病急、病死率高的特点[1]。研究发现[2-5]，早期适当的抗菌药物治疗可以改善血流感染患者的预后，而每延迟1 h 治疗，患者死亡率会增加9%，而血培养为诊断血流感染的“金标准”，其血液培养阳性的周转时间（turn-around time，TAT），即抗微生物药物敏感性试验报告结果是72～96 h。因此，改进方法缩短微生物鉴定和药敏试验的报告时间是目前微生物学检验面临的巨大挑战之一。研究发现[6]，利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）技术可对血培养阳性标本进行快速直接鉴定且具有较高的准确性。欧洲抗菌药物敏感性试验委员会（EUCAST）已经提出了抗微生物快速药敏试验（rapid drug sensitivity test，RAST），该方法是从阳性血培养瓶中取出标本直接进行药敏试验[7，8]。本研究应用MALDI-TOF MS 对细菌进行快速菌种鉴定，同时参考EUCAST 中血培养RAST 方法对肠杆菌目细菌和铜绿假单胞菌的血培养阳性标本进行药敏试验，并将结果与常规细菌鉴定和MIC 药敏结果进行对比，为建立血培养阳性标本快速鉴定及药敏试验方法提供依据。

1 材料与方法

1.1 标本来源 收集南京医科大学附属淮安一院检验科微生物室2021 年8 月-2022 年3 月血培养报警阳性标本共133 份（报警时间＜48 h），将同一人的同一天报警的重复标本及2 种以上菌混合感染的标本剔除。

1.2 仪器试剂 Bactec FX 全自动血培养仪和血培养瓶（美国BD 公司）、真空采血管（浙江龚东医疗器械有限公司）、基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱仪质谱仪（法国生物梅里埃有限公司）、琼脂培养基（郑州安图生物工程股份有限公司）、药敏纸片（赛默飞世尔科技＜中国＞有限公司）、细菌培养箱（赛默飞世尔科技＜中国＞有限公司）；全自动微生物鉴定及药敏分析系统VITEK2 Compact（法国梅里埃生物有限公司）、离心机（赛默飞世尔科技＜中国＞有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 血培养阳性标本快速鉴定及药敏试验①Vitek MS快速鉴定细菌：血培养瓶阳性报警后，取出血培养瓶内培养物进行革兰染色，当镜下显示单一革兰阴性杆菌时取1 ml 阳性血培养标本置于1.5 ml EP管，离心管中加入200 μl 5% SDS 溶液充分混匀，13 000 r/min 离心2 min，弃去上清液，加入1000 μl无菌蒸馏水，充分混匀管内悬液，13 000 r/min 离心2 min，弃去上清液，得到沉淀，取0.5 μl 沉淀点样至金属靶板，加1 μl 基质液，待靶板干燥后进行快速鉴定，质控菌株为大肠埃希菌ATCC8739 与产气肠杆菌ATCC13048；②阳性血培养液RAST 快速药敏鉴定：以质谱快速鉴定结果为革兰阴性细菌的血培养阳性标本作为RAST 的研究对象。参考2018 年EUCAST 公布的阳性血培养液RAST 方法[9]，从血培养瓶中直接吸取100 μl 培养液至直径90 mm 的M-H 平板上，均匀涂布平板后贴上抗菌药物纸片。质谱快速鉴定为大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌的药敏纸片包括庆大霉素（CN，10 μg）、头孢噻肟（CTX，5 μg）、哌拉西林/他唑巴坦（TZP，36 μg/6 μg）、头孢他啶（CAZ，10 μg）、美罗培南（MEN，10 μg）、阿米卡星（AK，30 μg）、环丙沙星（CIP，5 μg），妥布霉素（TOB，10 μg）；铜绿假单胞菌的药敏纸片包括庆大霉素（CN，10 μg）、亚胺培南（IPM，10 μg）、头孢噻肟（CTX，5 μg）、哌拉西林/他唑巴坦（TZP，36 μg/6 μg）、美罗培南（MEN，10 μg）、阿米卡星（AK，30 μg）、环丙沙星（CIP，5 μg），妥布霉素（TOB，10 μg），35 ℃温育4、6、8 h 后，分别量取抑菌圈直径，根据指南中不同细菌在不同时间的快速药敏折点判读药敏结果，质控菌株为大肠埃希ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853。

1.3.2 血培养阳性标本常规鉴定及药敏试验 当血培养仪提示阳性报警时，取出阳性瓶进行革兰染色并转种至相应的平板，分离出的单个菌落采用质谱仪进行鉴定。同时选择相应的药敏卡通过VITEK 2 Compact 进行抗菌药物敏感性分析。质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853。

1.3.3 药敏结果比较 比较RAST 药敏结果与常规药敏结果的一致性，判断标准如下：①结果符合（categorial agreement，CA）：常规药敏结果显示为敏感（或耐药），RAST 结果也为敏感（或耐药）；②错误（error，Er）：包括以下3 种情况：非常重大错误（very major errors，VME）：假敏感，即常规药敏结果判定为耐药，RAST 结果为敏感；重大错误（major errors，ME）：假耐药，即常规药敏结果判定为敏感，RAST 结果为耐药；微小错误（minor errors，mE）：常规药敏结果判定为中介，RAST 结果为敏感或耐药。无ATU 结果的判读及比较。

2 结果

2.1 Vitek MS 快速鉴定与常规鉴定结果比较 共分离出革兰阴性菌133 株。直接鉴定与培养后菌落Vitek MS 鉴定结果符合率为91.73%（122/133），其中鲍曼不动杆菌检出率最高，为100.00%（12/12），阴沟肠杆菌最低，为66.67%（6/9），见表1。

表1 Vitek MS 快速鉴定与常规鉴定结果比较[n（%）]

2.2 RAST 药敏结果判读 共对94 株革兰阴性细菌RAST 结果进行研究，所有药物CA 比例在4、6、8 h间呈现逐渐升高现象。在8 h 时除了TZP 和MEM，其他药物CA 均高于可接受值（CA＞90%）；94 例革兰阴性杆菌中仅有1 例铜绿假单胞菌对TZP 的药敏结果在6、8 h 时为VME，1 例大肠埃希菌对TZP、AK 在4、6、8 h 时为ME，2 例肺炎克雷伯菌的TZP、CAZ 在4、6、8 h 时为ME，1 例铜绿假单胞菌的TOB 和CN 在6、8 h 时为mE，见表2～表4。

表2 大肠埃希菌RAST 药敏结果与常规药敏结果一致性比较[n（%）]

表3 肺炎克雷伯菌RAST 药敏结果与常规药敏结果一致性比较[n（%）]

表4 铜绿假单胞菌RAST 药敏结果与常规药敏结果一致性比较[n（%）]

3 讨论

血流感染是引起患者死亡的主要因素之一，早期且准确的病原学检测和药敏结果对患者的诊治十分重要。MALDI-TOF-MS 是近些年发展起来的一种新型细菌鉴定技术，可以快速准确地进行细菌及真菌菌种鉴定，对培养后菌落的鉴定技术在临床已应用成熟。且菌落鉴定技术成本也远低于传统生化鉴定，极大缩短了菌株的鉴定时间[10]。现阶段MALDITOF-MS 技术对于标本的直接鉴定仍然为实验室检测的难点之一。采用不同方法处理血培养阳性标本后质谱直接鉴定的研究一直在不断的改进中，不同的前处理方法可直接影响细菌鉴定效果及结果的判定[11，12]。本研究中血培养阳性报警标本采用5% SDS（十二烷基硫酸钠）法处理后进行直接进行质谱鉴定，鉴定符合率为91.73%，与王岩等[13]研究报道的结果接近，且鉴定结果报告在1 h 以内，可为临床早期经验性用药及后续快速药敏结果判读提供快速可靠的病原学依据。

阳性血培养液快速药敏试验近年来已成为国内外研究的热点[14]。Sakarikou C 等[15]将阳性血培养液预处理后制备成0.5 麦氏浊度单位的菌悬液，使用全自动微生物鉴定及药敏分析系统VITEK 2 Compact 进行药敏试验，但此法耗时相对较长，获得最终药敏结果需18～24 h。Weme ET[16]利用分子生物学方法快速检测细菌的耐药基因，但检测成本较高，不适用于临床实验室常规开展。Faria-Ramos I 等[17]利用流式细胞术对细菌的代谢参数进行检测，可在3 h内检测细菌对抗菌药物的敏感性，但此法方法需要特殊仪器，一般实验室难以实现。2018 年4 月EUCAST 发布了阳性血培养液RAST 及折点，该方法是从阳性血培养瓶中取出标本直接进行药敏试验，操作简单、成本低、耗时短，易于临床实验室常规开展，目前革兰阴性杆菌中肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌以及铜绿假单胞菌可进行RAST，药敏结果最早可在4 h 内解读。

本研究结果显示，肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌以及铜绿假单胞菌的RAST 中的所有药物CA 比例在4、6、8 h 3 个点呈现逐渐升高现象。在8 h 除了TZP和MEM 两种药物，其他药物CA 比例均高于可接受值（＞90%）。94 例革兰阴性杆菌中仅有1 例铜绿假单胞菌对TZP 的药敏结果在6、8 h 时判读为VME，有1 例大肠埃希菌菌对TZP、AK 在4、6、8 h 时判读为ME，1 例肺炎克雷伯菌对TZP、CAZ 在4、6、8 h时判读为ME，1 例铜绿假单胞菌对TOB 和CN 在6、8 h 时判读为mE。不同抗菌药物在不同时间点判读的药敏CA 比例有所差别。陆燕飞等[18]研究报道，应用RAST 在6 h 判读肠杆菌目细菌药敏结果时，TZP 和MEM 分别表现出最低和最高的CA（91.10%vs98.90%）。本研究发现，6、8 h 的TZP 药敏判读结果CA 最低，与上述文献报道一致。虽然本研究检测到相比4 h，6 h 时大部分药物的CA 升高，但在6 h时TZP、MEM 及TOB 的ATU 比例仍然较高，CA＜90%，所以建议药敏结果报告必须在8 h 评估后提交。在本研究中，大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌对TZP、铜绿假单胞菌对MEM 的CA＜90%，这两种抗生素的CA 比例较低，与部分研究结果相似[19]。Soo YT 等[20]对148 例阳性血培养瓶RAST 和Vitek-2检测结果进行了比较，结果显示在8 h 时无VME，ME 检出率在3.3%～18.2%。与其报道的高ME 率相反，在本研究仅4 株菌株出现ME，1 株菌株出现mE。Martins A 等[21]检测36 株大肠杆菌和25 株肺炎克雷伯菌4 h 和6 h 对8 种抗菌药物的RAST 结果，发现CIP 和CTX 的ME 大于3%，在6 h 对AK和TZP 的mE 各为34.4%和21.6%，该研究建议RAST 可以代替除AK 以外的其他抗生素的传统药敏方法。本研究中，在8 h 时除TZP 和MEM 外，其他CA 均在可接受范围内，因此本研究建议对于革兰阴性杆菌的RAST 应谨慎使用TZP 和MEM 检测结果。这可能与本次选取的菌株数量不同及本地区的细菌耐药性分布不同所致，后续需要更多的血培养阳性培养液RAST 的数据资料来验证。

本研究不足：本研究中血培养阳性瓶培养液RAST 分析的数量不多，且未对革兰阳性菌的RAST进行评价。这些问题都有待进一步收集更多临床血培养阳性样本进行RAST 研究来解决。且RAST 方法本身也存在局限性，该方法不能对革兰氏染色后多种细菌混合感染标本及生长缓慢的细菌进行药物敏感性检测。在测量早期时间点的抑制区域，特别是4 h，由于在显影边缘细菌生长容易造成人为检测错误。基于RAST 研究应该增加多中心研究，这将有助于获得更多可靠的结果。

综上所述，革兰阴性杆菌血培养阳性标本采用5% SDS 沉淀法对样本进行前处理后采用MALDITOF MS 直接鉴定细菌准确性较高。在重症感染患者，尤其是败血症患者早期及时提供药敏结果进行治疗是非常重要的。许多新的技术方法旨在实现这一目标，但在资源有限的实验室中不适用。使用RAST 方法是一个切实可行的方法，在日常工作流程中可以实现，使血培养阳性的TAT 大大减少。根据RAST 结果可以指导临床用药，及时升级或降级抗生素治疗，这将有助改善重症患者的预后。然而该方法是劳动密集型方法，要求每4、6、8 h 阅读一次结果，因此，建议将8 h 作为单一的时间点阅读并报告结果最为准确。随着研究的不断深入，标本前处理方法的不断完善，MALDI-TOF-MS 细菌直接鉴定及RAST 的应用将会为临床重症感染患者的诊治提供更好的实验室依据和帮助。