miRNAs作为糖尿病肾脏疾病早期生物标志物的可行性及作用机制

邢晨皓，唐红悦，赵子今 综述，卢亚敏审校

1.河北北方学院研究生学院，河北张家口 075000；2.河北省人民医院核医学科，河北石家庄 050051

糖尿病肾脏疾病(DKD)是一种以持续性蛋白尿和肾功能进行性下降为特征的临床综合征，是一种典型的肾小球疾病，发病率逐年上升，已成为终末期肾病最常见的原因[1]，也是近几年暴发的新型冠状病毒感染严重结局的一项危险因素[2]。蛋白尿是目前临床上评估和监测肾功能的指标之一，但是约有1/3的患者在蛋白尿发生前就已存在肾功能下降，因而仅检测蛋白尿不足以监测DKD的发病率和进展[3]。事实上肾脏穿刺活检仍然是正确诊断DKD的金标准，但其为有创检查，不能被患者广泛接受，而且不能完全做到早期诊疗，它通常局限于显示非典型临床表现的病例。因此，DKD的诊断仍然具有挑战性，迫切需要高特异性、快速、非侵入性的生物标志物来诊断DKD[4]。微小核糖核酸(miRNAs)是普遍存在的内源性非编码单链RNA转录物，最常见的长度为19～25个核苷酸，通过阻断蛋白质翻译和/或诱导信使RNA降解作为基因表达的转录后调节物。有研究结果表明，miRNAs通过提供复杂的反馈系统来保持基因表达的稳定性，从而影响心脏、肾脏、脂肪和免疫组织中的干细胞活性[5]，并且在血液和尿液中稳定存在，其水平的高低影响疾病的进程，由此表明miRNAs有可能成为DKD的早期生物标志物。

1 miRNAs作为DKD早期生物标志物的可行性

众所周知，持续性高血糖是糖尿病并发症的主要诱因，有研究报道显示，不同浓度的葡萄糖对肾小球内皮细胞中miR-21表达水平的影响不同，提示肾小球内皮细胞miR-21表达水平明显上调，且miR-21的表达水平随葡萄糖浓度升高而逐渐升高，高浓度葡萄糖对miR-21表达水平的影响呈时间依赖性[6]。由此得出，检测血清miR-21表达水平将为DKD早期肾小球内皮细胞损伤的诊断和临床肾脏功能受损情况的评估提供更敏感而可靠的依据。

miR-638在DKD中表达水平下调，LIN等[7]研究证实，miR-638低表达可以将DKD患者与2型糖尿病患者及健康对照者区分开来，因此，miR-638可以作为DKD早期诊断的生物标志物。此外，miR-638可能通过调节增殖和炎症参与DKD，为DKD的治疗提供新的治疗靶点。JIA等[8]评估了在肾脏中呈高度表达的几种miR(miR-192、miR-194和miR-215) 在DKD早期诊断中的作用，比较了不同程度蛋白尿的2型糖尿病患者尿液中miR-192、miR-194和miR-215的表达水平，与微量清蛋白尿组比较，这3种miRNAs的表达水平均明显增加，且miR-192在区分正常清蛋白组和微量清蛋白组方面优于miR-194和miR-215；人肾小管上皮细胞暴露于高浓度葡萄糖会增加细胞上清液囊泡miR-192、miR-194和miR-215的表达水平，表明这些标志物是一种潜在的内源性来源，因此，可作为DKD早期诊断的生物标志物。

在对2型糖尿病患者的研究中发现，无论正常蛋白尿还是过量蛋白尿患者，血清和尿液中白细胞介素(IL)-1α、IL-8、IL-18与miRNA谱之间均存在显著相关性，miRNA-125a直接调控IL-6R，被认为参与了DKD的发病机制[9]。miRNA-126表达水平随着蛋白尿加重而下调，在早期阶段不能维持内皮细胞功能的完整性，与肾脏结构的改变密切相关。有研究报道血液中miR-377和miR-192作为DKD生物标志物的可能性，其受试者工作特征曲线(ROC曲线)分析结果显示这两种miRNA能够明显区分DKD患者和健康受试者，具有区分正常清蛋白尿和微量清蛋白尿/大量清蛋白尿的能力，并且miR-377表达水平随着清蛋白尿的严重程度加重而增加[10]。由此表明，在DKD早期血液中miR-377的表达水平就已经发生了变化，可以较早地提示DKD发生，可以作为DKD早期诊断的生物标志物。

2 miRNAs在DKD中的作用机制

导致DKD发生和发展的因素有很多种，其中高血糖状态是DKD发生和发展的基础环节,脂代谢紊乱是DKD发生的重要危险因素，炎症和氧化应激激活是DKD病变的直接诱因。

2.1miRNAs与糖、脂代谢 近年来，miRNAs已被证明在糖代谢调节的所有生理和病理过程中发挥关键作用，包括胰岛素利用、葡萄糖摄取和胰岛素分泌。miRNAs可能是维持葡萄糖稳态有希望的靶点[11]。miR-21可以通过靶向叉头框蛋白O1(FoxO1)通路介导的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶和葡萄糖-6-磷酸酶下调来降低糖异生，并且靶向3T3-L1脂肪细胞中的磷酸酯酶与张力蛋白同源物(PTEN)，导致胰岛素信号通路中PI3K-Akt激活的改变。miR-33a和miR-33b调节胰岛素受体底物(IRS)-2的表达，可以进一步影响信号网络中的下游蛋白，包括FoxO1细胞质定位和蛋白激酶B磷酸化(Akt磷酸化)。miR-155可以增强转基因小鼠肝脏、脂肪组织和骨骼肌中的糖酵解、IRS-1磷酸化和胰岛素刺激的Akt[12]。miR-185-5p通过靶向其 3′-非翻译区直接抑制葡萄糖6磷酸酶表达，抑制db/db小鼠肝糖异生和减轻高血糖作用。

有研究结果表明，miRNAs在调节脂质代谢中起至关重要的作用[13]，过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPAR-α)是脂质代谢的关键调控因子，糖尿病大鼠肾组织中miR-21表达水平明显升高，PPAR-α mRNA的表达水平明显降低，miR-21通过调控炎症因子(IL-6和IL-18)及凋亡蛋白Bax途径，进而抑制下游靶基因PPAR-α的表达水平，从而促进脂质代谢紊乱，加剧细胞炎症与凋亡反应。

2.2miRNAs与炎症 有研究报道显示，高血糖诱导的miR-467a-5p可以抑制与调节炎症有关的血栓反应蛋白-1产生[14]。给小鼠注射miR-467a-5p拮抗剂，抑制miR-467a-5p可导致脂肪组织中巨噬细胞浸润增加，脂肪组织中IL-6水平升高，血浆胰岛素水平升高和葡萄糖清除率降低；miR-467a-5p通过靶向血栓反应蛋白-1来调控炎症。miRNAs在DKD发展过程中的调节作用尤为突出[15]，在不同严重程度的DKD中，miRNAs通过PTEN、PI3K/Akt和丝裂原活化蛋白激酶通路对转化生长因子(TGF)-β进行调节，从而控制不同炎症程度的表达。高糖通过己糖胺生物合成途径代谢介导细胞外基质的产生和炎症通路激活，刺激肾脏细胞中的TGF-β转录活性增加；同时己糖胺生物合成途径产生活化的氨基糖UDP-N-乙酰基葡萄糖胺，催化蛋白质葡萄糖胺糖基化，影响一系列细胞过程，包括炎症、新陈代谢、运输和细胞骨架组织，在DKD的发展中起作用[16]。

有研究发现，miR-192在正常肾皮质中富集，且miR-192可能是肾脏病理改变过程TGF-β1/Smads信号传导通路的重要下游介质[17]，所以miR-192对TGF-β1/Smads 炎症信号通路具有调控作用。在DKD肾组织和高葡萄糖刺激的足细胞中miR-770-5p表达水平上调[18]，敲低miR-770-5p可以抑制足细胞凋亡和炎症，表明miR-770-5p可能是DKD的潜在治疗靶点。

晚期糖基化终产物(AGEs)/高级糖基化终产物受体相互作用可触发活性氧(ROS)生成并激活下游信号通路，诱导内皮祖细胞凋亡，AGEs在体内积累会引起一系列氧化应激反应及炎症[19]。有新的证据表明，miRNAs与DKD中AGEs介导的病理改变有关,经AGEs处理的内皮细胞通过上调RhoA/ROCK2信号通路抑制miR-200b/miR-200c的表达[20]。miR-92b-3p在AGEs对大鼠DKD模型中的表达水平变化最为明显，miR-92b-3p可以与AGEs介导的Smad7的非编码区相互作用，使Smad7成为DKD相关的miRNAs的下游靶点[20]。

在DKD大鼠组织和高葡萄糖处理的肾小管上皮(HK)-2细胞中均发现miR-365的表达水平升高[21]。miR-365可调节脑源性神经营养因子中的原肌球蛋白相关激酶B信号轴诱导DKD纤维化。而沉默miR-365抑制了HK-2细胞中细胞外基质(ECM)成分的积累和炎症细胞因子的分泌，敲低miR-365可抑制脊髓性肌萎缩症，降低胶原蛋白Ⅳ、TGF-β1、肿瘤坏死因子-α和IL-6水平，由此表明敲低miR-365可抑制肾纤维化。

2.3miRNAs与氧化应激 miR-377在DKD的体外和体内模型中均被证实为过度表达，其水平增加抑制了p21活化激酶和锰超氧化物歧化酶1、2的翻译，并增强了纤维连接蛋白产生[22]，其成分的增加可导致系膜基质增多、系膜区扩张,最后导致弥漫性肾小球硬化和间质纤维化。有研究报道显示，miR-4449水平在DKD患者血清外泌体中呈高表达，通过调控IL-1β和IL-18水平，以及ROS水平和焦亡，从而在DKD的发病机制中起关键作用[23]。此外，无论在DKD患者还是HK-2细胞中癌症超甲基化1(HIC1)蛋白的表达与miR-4449的表达均呈负相关，HIC1通过调控炎症和miR-4449/HIC1通路促进细胞焦亡和氧化应激。

miR-21在对照组、DKD早期和中晚期表达水平依次降低，各组间均有明显差异，miR-21与氧化应激指标丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、高级氧化蛋白质产物及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(NOX4)均呈负相关，与血红素加氧酶1呈正相关，进而使肾脏组织遭受氧化应激损伤,最终表现在氧化应激指标水平明显异常[24]。miR-21参与发病进程的具体机制主要可能是由PTEN/Akt、TGF-β/Smads及基质金属蛋白酶等有关信号途径而实现，再次证实血清miR-21与其机体的氧化应激反应联系紧密。同样也有相似报道显示，DKD患者miR-21与SOD、MDA、NOX4、胱抑素C均有明显相关性，且ROC曲线分析结果显示miR-21有较高的灵敏度和特异度[25]，由此提示，miR-21对早期DKD的诊断有较好的价值，其与糖尿病患者肾功能损伤、氧化应激状态具有密切关系。

有报道显示，miR-205协同高迁移率族蛋白B1(HMGB1)在DKD发生和发展中起重要作用[26]，HMGB1被鉴定并证实是miR-205的靶标，miR-205通过靶向HMGB1对高葡萄糖诱导的细胞损伤起保护作用。过表达miR-205 或敲低脂蛋白受体6可抑制核因子κB信号通路，进一步调节高葡萄糖诱导的系膜细胞增殖、氧化应激、ECM积累和炎症。

3 小 结

尽管DKD的发生机制还未完全阐明，但miRNAs的发现为DKD的分子水平研究提供了新的方向。miRNAs与DKD的关系还需要更多的临床研究来证明，对miRNAs的深入研究及相关作用机制靶点的认识与探索，将为DKD的早期诊断和治疗带来新的思路和方法。