代谢组学在桃果实风味领域的应用进展

徐 冰，冯 涛

（上海应用技术大学香料香精化妆品学部，上海 201418）

桃（Prunus persicaL.）是蔷薇科（Rosaceae）桃属（AmycdalusL.）植物，是世界广为熟知的重要水果之一，也是重要的经济作物，其种植历史可追溯到4 000 年以前，原产自中国，在北纬23～45°范围内有广泛的栽培[1]。香气作为桃果实风味的重要组成部分，它的缺失极大地影响桃的感官品质，且降低人们的喜爱程度，从而影响其经济价值。有研究证明低温生产可以延长桃果实的保质期，但对果品的伤害比较明显，常见的有冷害，从而间接导致某些重要香气化合物的损失，影响桃果实的质量[2]。因此，在避免桃果实重要风味物质和感官特征损失的前提下，提高桃果实风味品质质量，调控桃挥发性风味物质的产生途径，是桃育种栽培的一个重要环节。

代谢组学是20 世纪后期发展起来的一门新技术，用于对动物、植物和微生物细胞中所有分子量小于1 ku 的代谢物进行定性和定量分析，是继基因组学[3]、转录组学[4]和蛋白质组学[5]之后系统生物学的又一研究重点，同时也是当前代谢组学研究领域的一个热点[6]。鉴于桃果实的质量对其感官品质有着重要的作用，研究者尝试将代谢组学与桃果实香气研究相结合，通过对其香气挥发物代谢途径及机理的研究，鉴定出香气物质合成途径中的关键酶基因，并在2011 年就已经完善了全套桃基因的草图[7]。本文通过总结桃果实在风味代谢组学研究方向的相关进展，以期推动代谢组学技术在桃果实风味领域的发展，并提供相关理论依据。

1 桃的分类及研究方法

桃是一种果实可食用的落叶小乔木，花可供观赏，果实多汁，可以生食或成制桃脯、罐头等，核仁也可以食用。“寿桃”和“仙桃”都是历年来桃所获得的美称，因其果肉鲜美，被誉为“天下第一果”。桃有黄肉桃和白肉桃之分，富含蛋白质、脂肪、碳水化合物、粗纤维、钙、磷、铁、胡萝卜素、维生素B1、有机酸（主要是苹果酸和柠檬酸）、糖分（主要是葡萄糖、果糖、蔗糖、木糖）和挥发油等，适合低血钾和缺铁性贫血患者食用[8]。

1.1 桃的分类

中国是桃产量最大的国家，其次为美国、日本和意大利。据统计，中国的桃树品种可达上千个[9]。根据桃的使用目的可分为可食用类和观赏类，如蟠桃和油桃为可食用类，寿星桃和碧桃为观赏类。目前研究桃果实香气物质的品种大多为可食用类，对观赏类的桃品种研究较少。

1.2 桃基因组建立

基于桃基因组不是很大，染色体数量又相对偏少（2n=16），其由单基因控制的性状相对较多，且目前我们已在桃果实的基因组学研究领域获得相当大的进步，测得桃基因组大小约为224.6 Mb，基因组覆盖深度为8.5倍，通过高通量测序共得到3 729 679 条测序编码，27 852 个蛋白编码基因和28 689 个蛋白编码转录本[10]。目前，在对桃香气物质的合成以及冷害造成的相关遗传机制的研究中，已经应用到全基因组重测序和高密度SNP（single nucleotide polymorphisms）芯片构建。Eduardo等[11]通过鉴定“Bolero”（B）和“OroA”（O）杂交的126 株幼苗的F1 代的果实挥发性有机化合物（volatile organic compounds，VOC）的数量性状基因位点（quantitative trait loci，QTL），以了解其遗传基础，使用International Peach SNP Consortium peach SNP array v1 芯片，构建了覆盖桃基因组8 个连锁群的密集SNP 和SSR 图谱，获得了23 种具有高“气味活性值”的VOCs，其中主要QTL 为壬醛、芳樟醇及1-对薄荷烯-9-醛，且找到了2 个萜烯类合成酶基因和1 个脂氧合酶基因。同时，已有相关研究报道了桃可溶性糖和有机酸方面的代谢途径及相关质地转变的代谢组学进展[12]。

2 桃代谢组学研究方法

自20 世纪70 年代，Devaux 等[13]首次基于代谢轮廓分析（metabolic profiling）提出代谢组学（metabolomics）释义后，代谢组学经过多年发展逐渐成熟，形成metabomics和metabonomics 两种概念。其中metabonomics 是一种对代谢物相关信息的动态研究，而metabolomics 是对单个代谢体系的静态研究[14]。代谢组学是一门基于多种分析技术的快速发展的学科，各种来自动物、植物和微生物的小分子代谢产物都可以成为其研究对象。由于研究对象的质量和方向的不同，其实验前处理、测试和分析方法也随之变化。本文就代谢组学在桃果实风味研究领域中的应用情况作一综述，代谢组学的研究步骤分为样本收集、代谢物提取、检测分析鉴定以及数据处理。

2.1 样品收集

桃样品在栽培过程中容易受到植株品质和生长环境的限制。为了避免在分析过程中出现较大误差，需要手动严格控制培养条件，减少样品之间的差异。为了增加样品数量并减少检测误差，应尽可能选择外观和轮廓相同的平行样品。取样后应及时对样品进行灭活。灭活是指细胞内代谢酶活性迅速降低或停止，使代谢反应停止，并确保样本中实时代谢信息能够被有效反应。理想的灭活效果是使酶迅速失活和保证细胞不被破坏。桃果实代谢组学研究中主要使用的两种灭活方法为液氮冷冻和高氯酸灭活[15]。

2.2 代谢物提取

为了代谢物分析结果的有效性能够得到最大保证，理想状态下的代谢物提取过程应达到包含提取完整、无偏向、不能破坏代谢物的物理化学和生物学特性的效果[16]。常见的桃果实代谢物萃取方法有固相微萃取法、超临界流体萃取法、溶剂辅助风味蒸发法等[17]。酸、碱提取方法是常用的方法，其中甲醇-氯仿法对非极性代谢物的提取效果较好，因为极性高的代谢物不易溶于甲醇和氯仿，从而间接影响了提取效果，此外，该方法还存在操作时间长、氯仿毒性大等缺点[18]。Lillocarmona 等[19]采用甲醇-氯仿法对冷藏前后桃子的代谢物进行提取分析，共鉴定出119 种代谢物和189 种脂类，其丰度差异显著的主要是氨基酸、糖和脂类。而桃果实风味主要与有机酸等非挥发性有机物和部分VOCs 有关，说明桃风味易受低温的影响。

2.3 代谢物分离鉴定

代谢组学研究的核心组成包括代谢物的分离鉴定和分析。由于不同物种的代谢物的多样性相异，且植物代谢物的多样性远远高于动物和微生物的，因此分析桃风味相关代谢物的分析平台就需要具备灵敏度高、效率高、分辨率高、高通量的四高特点[20]。对样品进行代谢组学分析的完整步骤应包含代谢物的分离、检测分析、数据处理[21]。桃样品处理之后，最重要的就是选出能够将所有代谢物都分析出来的技术手段[22]。气相色谱法（gas chromatogram，GC）、毛 细 管 电 泳 法（capillary electrophoresis，CE）和液相色谱法（liquid chromatogram，LC）是常用的分离方法[21]。代谢组学常用的检测手段是质谱（mass spectrometry，MS）和NMR。GC-MS 是常应用于桃果实代谢组学领域的分离检测技术，灵敏度高、分辨率高，且自带数据库，可以减少检测过程有关数据匹配搜索的繁琐步骤，但它的缺点同样也十分明显，不能对非挥发性、热敏感、极性过强和分子量过大的物质进行有效的检测[23]，而LC-MS 则可以弥补这一缺点，因为其对非挥发性物质特别是酚酸等桃果实风味代谢物的分离优势更明显[24]。目前集成的核磁共振平台已经开发出来，可以监测初级代谢产物和次生代谢产物的变化，并可用于研究桃果实在成熟前后的代谢变化[25]。除了以上方法外，还有光谱法结合多种分析法进行的代谢组学研究，如傅里叶红外光谱法（fourier transform infrared spectroscopy,FTIR）分析桃果实中的有机酸和糖[26]。

2.4 数据分析

化学物质的定性定量和统计学分析是对样品代谢物相关数据处理及分析的主要手段，可以通过标准品的保留时间和数据库检索来对分离所得到的化学物质进行定性，通过谱图中色谱峰的峰面积来进行定量，多维数据分析法（multivariate data analysis，MVDA）为代谢组学数据分析的常用手段[27]，包括以主成分分析法（principal component analysis，PCA）为主，非线形映射法（nonlinear mapping，NLM）、聚 类 分 析 法（hierarchical cluster analysis，HCA）等为辅的非监督学习方法和以偏最小二乘分析法（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）为主，软独立建模法（soft independent modeling of class analogy，SIMCA）和神经网络法（artificial neural network，ANN）等为辅的监督学习方法[28]。BioCyc、EMP、MctaCyc 等都是用来对代谢物信息分析的常用数据库，常用分析软件有MATLAB、SAS、SPSS、SIMCA 等[29]。但是目前仍然缺乏一个标准系统性的代谢物数据库，还需研究人员共同推进代谢物数据库的建立。

3 桃果实香气化合物的主要合成代谢途径

根据香气形成的前体物质不同，将果实中挥发性和非挥发性风味物质的代谢合成途径分为碳水化合物代谢途径、脂肪酸代谢途径和氨基酸代谢途径，其中碳水化合物代谢又分为呋喃酮代谢和萜烯代谢，呋喃酮代谢合成的香气，多是一些味道较为甜腻的水果中产生，而萜烯代谢合成的香气物质多为柑橘类水果所有[30]。由于桃果实中呋喃酮类的香气成分较少，本文不予讨论。

3.1 脂肪酸途径

脂肪酸代谢主要分为两条途径，一条是脂类物质，主要是亚油酸和亚麻酸在脂氧合酶（lipoxidase，LOX）的作用下直接生成六碳化合物和醇，其次是酯类物质经由β-氧化生成酮酸、酰基辅酶A，再生成醇类和醛类物质[31]。有相关研究证明，六碳化合物主要是用来体现桃果实中青草香的挥发性物质，如戊醛、庚烯醛等的合成都是通过以脂肪酸为前体物质，经脂肪酸途径和β-氧化等一步步氧化、裂解和还原而形成[32]。作为对脂肪酸代谢起关键作用的酶，酶反应底物如亚油酸和亚麻酸浓度的高低会直接影响LOX 反应活性，从而间接影响香气物质的释放量[33]。LOX 途径的特定反应始于甘油酯和其他物质与脂肪酶反应中饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸的释放。六碳醛和醇的产生是受到过氢过氧化物裂解酶（HPL）和乙醇脱氢酶等一系列酶催化的，最后在醇酰基转移酶（alcohol acyltransferase，AAT）催化下形成酯。在将醇类物质转化为酯类物质的过程中，AAT 功不可没。它催化酰基和以不同方式合成的各种醇类物质之间形成各种酯类物质。因此，其含量会影响桃果实中酯类芳香物质的形成，LOX途径在催化酯类物质合成的过程中的酰基主要来自酰基辅酶a。

已知羟基脂肪酸作为内酯类物质的生物合成来源，其通过β-氧化形成4-或5-羟基酸，再经过自环化或在AAT 的催化下形成相应的内酯。而合成内酯类物质的另一个途径是饱和脂肪酸的β-氧化，乙酰辅酶A 是参与该过程的关键酶，其中体现桃果实香气的γ-癸内酯就是在该酶的辅助下逐渐形成的。目前已知，许多芳香环氧化物都是可以经过环氧化物水解酶（epoxide hydrolase，EH）水解产生的。且在内酯类物质的相关代谢中，脂肪酸经过环氧化后，通过EH 来进一步掌握对环氧化物环的裂解，从而形成羟基脂肪酸，然后再由β-羟基脂肪酸加工、β-氧化等一系列反应，最终得到内酯类物质。

3.2 萜类合成途径

萜烯类挥发性化合物作为一大类植物芳香物质，许多植物香气的成分都包括单萜类和少数倍半萜类物质。五碳前体物质异戊二烯的形成是受到萜类合酶的作用，所以异戊二烯途径是萜类合成途径的一种另称，萜烯类物质也叫类异戊二烯化合物[34]。酮类香气物质也是通过这种代谢途径合成。香叶基焦磷酸（geranyl geranylpyrophosphate，GPP）是所有单萜的前体物质，而合成GPP 则需要异戊烯焦磷酸（isoprene pyrophosphate，IPP）或其异构体二甲基烯丙基焦磷酸（dimethyl allyl pyrophosphate，DMAPP）为前体。根据异戊二烯结构骨架的数量，将这些产生五碳前体的途径分为两条：一条是发生在细胞质中的甲羟戊酸（mevalonic acid，MVA）途径，该途径中的关键酶是乙酰辅酶A；另一条途径则为甲基赤藓糖醇磷酸途径（methyl erythriotl phosphate，MEP），MEP途径从丙酮酸和D-甘油醛-3-磷酸缩合，形成1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸开始，最终得到这些五碳化合物包括单萜、倍半萜、三萜类。在受萜类合成酶催化的过程中，研究人员对单萜类形成起到催化作用的各种酶类物质的关注度不断提高，其中就有形成芳樟醇的芳樟醇合成酶，而其则是桃果实的特征香气中的一种[35]；类胡萝卜素是作为β-紫罗兰酮等物质的合成前体的，且给桃果实倍半萜挥发物的合成带来促进作用的关键酶就是类胡萝卜素裂解双加氧酶（carotenoid cleaving dioxygenase，CCD）。

3.3 氨基酸途径

氨基酸途径是以芳香氨基酸为合成前体物质，是桃果实中芳香特征香气挥发性化合物合成的主要方式。桃中富含的氨基酸种类有很多，目前有相关研究证明缬氨酸、苯丙氨酸和甘氨酸等物质含量的变化与芳香物质呈正相关。它是一种合成前体物质，对桃果实的风味成分影响很大。首先L-苯丙氨酸作为苯丙氨酸解氨酶催化的主要底物，经过酰基化、甲基化、羟基化等反应，最终生成苯乙醛、苯乙醇等挥发性香气化合物[36]。可能参与合成的酶包括丙酮酸脱羧酶、芳香族氨基酸氨基转移酶、芳香族氨基酸脱羧酶等[37]。桃果实中的香气成分大部分是醇、酸、酯类化合物，这些化合物合成的很大一部分香气前体物质来自氨基酸，常见的氨基酸代谢香气前体物质是丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸等，在转氨酶和丙酮酸脱氢酶作用下，经转氨基和脱羧两步反应得到香气物质[38]。

4 代谢组学在桃果实香气物质研究领域的相关应用

代谢组学作为应用驱动的一个新的研究方向，在药物毒理学与动物模型、食品营养与安全、疾病诊断与治疗、植物育种与抗性研究等方面具有较高的研究价值，而在植物果实香气分析方面研究较少。

4.1 桃果实遗传基因的代谢组学研究

桃风味物质的组成和含量高低会受遗传因素的影响，且不同品种其基因的变化也会间接影响到其它风味物质的相关指标。谢凯丽[39]采用顶空固相微萃取（headspace solid phase microextraction，HS-SPME）联合气相色谱质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）并结合转录组测序（RNA sequencing，RNA-Seq）的方法对128 种不同种资源的桃果实香气物质进行PCA 和聚类分析发现，这128 种桃可分为5 类，A 类桃的香气物质主要以内酯类物质为主，含量占比约为44%，特征香型为“桃香型”，入选的桃品种大多为蟠桃；B 类桃的香气物质主要以萜类物质为主，含量占比约为57%，特征香型为“花香”，入选的桃品种大多为水蜜桃；C 类桃的香气物质主要以酯类物质为主，含量占比约为34%，特征香型为“果香”，入选的桃品种大多为黄桃；D 类桃的香气物质种类较为复杂，包括C6化合物、萜烯类、酯类、醇类物质，特征香型为“混合香”，入选的桃品种也比较分散；E 类桃的香气物质主要以C6化合物为主，含量占比高达56%，特征香型为“青香”；由此可见，品种不同导致基因表达相异，从而桃果实的香气物质种类和含量也大有不同。

4.2 桃果实采前采后风味物质变化的代谢组学研究

桃果实采摘前栽培管理措施对桃果实香气物质形成的影响也比较突出，比如灌溉和光照，不同冠层位置的果实暴露在不同的光照环境中，影响其成熟过程和内部品质发育。Anthony 等[40]通过采用GC-MS 联用技术，对同样成熟的桃果实样品的中果皮和外果皮进行了非靶向代谢物图谱分析。来自不同冠层位置同样成熟果实的中果皮代谢产物图谱显示，其代谢变化最小。然而，HV品种的外果皮冠层代谢产物存在显著差异。一般而言，蔗糖、山梨醇和儿茶素质量较高，而天冬氨酸、天冬酰胺、苏氨酸、柠檬酸、单糖（山梨糖和果糖）、丁酸和莽草酸在低光环境果实中质量较低。总之，这种生理和代谢组学的分析提供了深入了解冠层位置的真实影响，并强调了光环境相关的促进桃果实品质发育的代谢调控。采后贮藏过程中的果实呼吸直接影响主要的代谢途径，如糖酵解、淀粉代谢和三羧酸循环，这些途径解释了糖、氨基酸和有机酸水平的变化。事实上，碳水化合物、有机酸、蛋白质和脂肪是水果贮藏过程中主要的呼吸底物，而消费者对水果的接受程度则直接受到糖和酸含量以及两组初级代谢物比例的影响[41]。

4.3 桃果实成熟度的代谢组学研究

成熟是一个在分子水平上高度调控的过程，显著影响果实质量[42]。Liu 等[43]发现对不同成熟期的水蜜桃用于果酒制备的质量指标和香气特征之间存在显著差异，试验将采收时的水蜜桃按照成熟度分为四组，并对四组酒样的理化性质、生物活性成分、颜色、透光率、挥发性风味成分和感官接受度进行了考察，结果表明，水蜜桃成熟度越高，颜色强度、单宁含量、酯类含量也就越高，而果酒的总酚含量、总黄酮含量和透光率却偏低。且随着蜜桃成熟度的增加，风味和口感上的平衡得到改善，而过熟的水蜜桃产生的一些腐败酸是导致果酒产生不愉快味道的主要原因。综上所述，水蜜桃制备果酒的最佳采收期为90%～100%成熟度的时期。这些结果表明，水蜜桃成熟度可能影响最终的果酒成分和质量，应在制备时加以考虑。桃子加工类的产品（如果酒、果汁、果酱和果冻）的质量在很大程度上取决于酚类化合物的含量和多酚氧化酶的活性，因为桃子在加工过程中很容易受到不良酶促褐变的影响[44]。

4.4 桃果实贮藏条件的代谢组学研究

桃是世界上第三大重要的温带水果作物。由于出口市场的长途性质，桃子的出口是一个挑战。这需要对桃进行长时间的冷藏，易导致一种被称为寒伤的生理紊乱现象。Brizzolara 等[45]对三个品种桃在采摘后低温储存4周后，采用GC-MS 对三种桃果实的代谢物进行检测分析，发现在三个品种中，棉子糖、葡萄糖-6p、聚焦糖、木糖、山梨醇、GABA、表儿茶素、儿茶素和腐胺在冷藏过程中显著增加，而柠檬酸、葡萄糖醛酸、芥子酸和莽草酸则降低。在冷藏过程中香气化合物含量及种类也有显著的变化，例如，醛类和醇类在冷藏过程中通常积累更多，而酯类和内酯的产生受到强烈抑制。在冷藏后的货架期过程中，能检测到更具体的反应，每个品种都以特定的方式表现，可检测到一些常见的反应，如乙酸乙酯的产量增加。

5 展望

桃果实芳香品质研究已取得深入进展，当前已鉴定出大量与挥发性物质有关的桃果实香气特征，并通过不断加快对合成相关生物代谢途径的探索和桃果实全基因组测序的步伐，将会促进分离鉴定与桃香气化合物代谢有关的基因的发展，但相比较其他科的植物，桃果实作为蔷薇科植物的一种，还有相当多的研究工作需要进行补充和完善。由于桃果实香气化合物合成多样性太繁杂，且相关代谢物调控的机制过于复杂，所以目前我们还需就控制相关酶的活性出发，来进一步调整桃果实的香气产生，为这些与代谢相关的酶和基因是如何对外界带来的刺激产生一系列反应的行为，为快速掌握桃果实香气化合物的合成代谢途径，特别是有关转录和翻译水平的调控作进一步的探索。开展桃果实香气合成代谢组学的研究，可迎合消费市场需求，通过分子辅助的手段为桃新品种的培育提供相关理论依据。