‘阳光’佛手柑特征香气成分的GC-MS分析及感官评价

蔡尉彤，许 滢，冯 涛，王化田，宋诗清，姚凌云，孙 敏，柳 倩，于 闯

（上海应用技术大学香料香精化妆品学部，上海 201418）

佛手柑是芸香科柑橘属的香橼变种，别名佛手香橼、五指橘、福寿柑、蜜罗柑等，因果实形状弯曲修长似手指，故称其为“佛手”。佛手柑以果入药，是我国常用的中药材，又因造型独特成为名贵的观果、观叶植物[1]。我国佛手柑的种植历史已有上百年之久，产地主要分布于闽、粤、云、川、江、浙等地，其中产自浙江金华的金佛手凭借优越的地理位置和生长环境，成为我国佛手品系中的上品，堪称“果中之仙品”。

目前的研究主要集中在金佛手果实或精油中的挥发性香气成分的组成上，主要有萜烯类、醛类、醇类、酮类、酯类、香豆素类等[2]，其中相对含量占比较大的多为萜烯类物质中的柠檬烯和γ-松油烯[3-4]，并且金佛手的果皮比果肉更富含香气物质[5]。然而，仅通过GC-MS 分析得到各组分相对含量的大小，并不能确定金佛手的关键香气成分，因为水果或食品饮料中大部分的挥发性物质组分对整体香气完全或几乎没有影响[6]。为进一步得到关键香气物质，宋诗清等[7]以香气活力值（odor activity value，OAV）为变量指标，建立线性回归模型得到对金佛手整体香气贡献程度较大的组分，以及确定其特征香气组成。杨君等[8]结合气相色谱嗅闻技术（gas chromatography-olfactory，GC-O），更准确地定性验证得到金佛手的关键致香成分及其主体香韵。这也为从挥发性物质组分中筛选得到特征香气成分提供了更准确的研究方法和思路。

本试验采用顶空固相微萃取（HS-SPME）富集提取挥发性物质成分，通过气相色谱质谱技术结合香气强度法的嗅闻检测（GC-MS-O）分析鉴定得到‘阳光’佛手柑的香气成分，再运用定量描述分析（quantitative descriptive analysis，QDA）法进行感官评定，来验证‘阳光’佛手柑的特征香气成分，为金佛手的新品种‘阳光’佛手柑的香气构成提供一定的理论参考和依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

‘阳光’佛手柑：产自金华农业科学院Finger Citron研究所；2-辛醇，色谱纯，上海源叶生物科技有限公司；C7～C40正构烷烃，色谱纯，美国Sigma-Aldrich 公司。

1.2 仪器与设备

8860-5977B 型GC-MSD 联用仪，美国Agilent 公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS 萃取头，上海安谱实验科技股份有限公司；8860（FID）-ODP3 GC-O 装置，德国Gerstel公司；数显恒温水浴锅，上海博迅实业有限公司医疗设备厂。

1.3 试验方法

1.3.1 顶空固相微萃取

顶空固相微萃取（headspace solid phase micro-extraction，HS-SPME）富集挥发性物质组分将冷冻的佛手柑果实直接用剪刀将果实剪碎，称取2.50 g 的佛手柑样品并装入15 mL 顶空瓶中，加入40 μL、内标物浓度为100 mg/L 的2-辛醇溶液，将顶空瓶置于60 ℃恒温水浴锅中平衡20 min。将老化好的萃取头插入顶空瓶瓶口的三分之一处，60 ℃下顶空吸附萃取30 min，待完成萃取后拔出，准备进样到气相色谱仪的进样口中。

1.3.2 GC-MS 参数条件

色谱条件：手动进样，不分流模式，极性DB-WAX柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm）；溶剂延迟5 min；进样口的温度250 ℃，起始温度40 ℃，保持3 min，以3 ℃/min 升至100 ℃保持0.5 min，再以5 ℃/min 升至230 ℃，保持20 min；载气为氦气，载气流量1.0 mL/min。

质谱条件：运行时间60 min；全扫描模式；电子轰击电离源（electron impact ion source，EI），电子能量70 eV；MS 离子源温度为230 ℃（最大值250 ℃），四级杆温度150 ℃；扫描质量范围m/z50～500 amu；阈值50。

1.3.3 GC-O 检测方法

气相色谱-嗅闻系统由GC（配氢火焰离子检测器FID）和ODP3 嗅辨仪组成。色谱条件及升温程序同GC-MS，嗅闻采用香气强度法进行检测，此方法基于气味强度的估测[9]，同时还能验证挥发性香气物质的相对含量大小[10]。当嗅闻员靠近吸嗅装置嗅闻时，还需记录下气味强度以及该组分的香气特征描述。气味强度值越大，就表明该组分对香气整体的贡献程度越大，可以初步判断为特征香气成分。气味强度采用五级气味强度表示法来评定，见表1[11]。

表1 五级气味强度表示法Table 1 Descriptions of the five-level odor intensities

1.4 挥发性物质的定性和定量分析

1.4.1 定性分析

挥发性物质组分的定性以质谱标准谱库、保留指数（retention index，RI）的定性为主，通过检索NIST 标准谱库（NIST Chemistry WebBook，SRD 69）输入物质组分的CAS 号，找到与实验所用的极性毛细管柱型号相同的一栏记录查找得到的保留指数，再通过计算得到RIs 与查找值进行对比，误差小于50 即可保留，表示对挥发性组分进行定性确认。未知化合物的RIs 借助C7～C40的正构烷烃在相同的GC-MS 参数条件下测定得到的保留时间计算得到，计算公式见式（1）[7]。

式中，RTX为挥发性物质组分的保留时间，min；RTZ为与挥发性组分具有相同碳原子数的正构烷烃的保留时间，min；Z为某一正构烷烃的碳原子数；经色谱柱分析，组分X的峰正好在正构烷烃碳原子数Z和Z+1 之间。

1.4.2 定量分析

采用内标法进行简单定量，内标物选用浓度为100 mg/L 的2-辛醇溶液，求得每一种挥发性香气物质组分的相对含量Wi后，通过检索风味阈值[12]，查找每一挥发性物质在水中的察觉阈值，以求得各挥发性香气物质组分的香气活力值OAV，OAV＞1 的物质可判断为主要香气物质。计算公式见式（2）（3）。

式中，Wi为待测挥发性组分的质量浓度，μg/L；Cs 为内标物的浓度，μg/L；Vs 为内标物加入的体积，μL；m为称取的佛手柑样品质量，g；APi 为挥发性组分的峰面积；APs 为内标物的峰面积。

式中，Wi为计算出的质量浓度，μg/L；DT为挥发性组分在水中的察觉阈值，μg/L。

1.4.3 QDA 感官评价

定量描述法是评估员通过建立感官描述词以及对各项感官特性的强度大小进行打分评价的一种检验方法，可单独或结合用于样品外观、香气、口味等评定[13]。本实验以GC-O 的嗅闻结果作为参考来建立感官特性描述词，2 位评估员来自上海应用技术大学香料香精化妆品学部，根据感官评分表2[14]进行打分，通过评分结果绘制得到类似蜘蛛网的香气轮廓图，以此直观地看出‘阳光’佛手柑的香韵组成特点，从而验证‘阳光’佛手柑的特征香气成分[14]。

表2 感官评分表Table 2 sensory evaluation score scale

1.5 数据处理

气相色谱质谱的分析采用Nist11 数据库。使用WPS Excel 2017 进行数据处理，计算RI 值并与Nist11 数据库中的RI 查找值进行匹配，计算各香气成分的相对含量、OAV 值大小。以OAV 值为基础，通过Excel 2017 进行雷达图的绘制。

2 结果与分析

2.1 ‘阳光’佛手柑香气成分分析

采用HS-SPME 技术富集提取‘阳光’佛手柑中的挥发性香气成分，经GC-MS 分析与分离，共检测得到167种挥发性物质组分。如表3 所示，共发现34 种挥发性香气物质，其中萜烯类化合物19 种，相对含量占比90.49%；醛类化合物5 种，相对含量占比4.15%；芳香族化合物4 种，相对含量占比2.95%；醇类化合物5 种，相对含量占比2.32%；酮类化合物仅有1 种，且相对含量占比较少，未超过1%。这些香气物质组分大多数都是碳原子数为10 或15 的萜烯类化合物以及分子结构简单的含氧类化合物，共同构成了‘阳光’佛手柑的香气。

香气成分的种类和含量是决定果实香气或风味口感的关键因素，研究金华佛手柑的香气物质成分可提高佛手柑品质和培育优质品种[15]，为金华佛手柑香气的组成提供理论依据和参考。果实的香气来自被分离出的各挥发性组分，但并不是分离得到的组分含量较大就是香气组成中的关键成分，只有香气活力值较大的物质组分才能对香气的整体贡献度有一定影响，即被认定为是特征香气成分或关键致香成分。

2.1.1 萜烯类化合物

由表3 可知，‘阳光’佛手柑中共检测得到19 种萜烯类化合物，其相对含量之和占总香气成分含量的90.49%，是‘阳光’佛手柑香气组成中较为重要的一类物质组分。其中相对含量最高的是D-柠檬烯（42.92%），其次是γ-松油烯（34.19%）、β-罗勒烯（3.78%）、异松油烯（2.94%）、月桂烯（1.83%）、β-石竹烯（1.52%）、β-甜没药烯（1.41%）以及总占比小于1%的水芹烯、α-蒎烯和3-蒈烯等。这些萜烯类物质主要的分子式为C10H16的单萜烯类化合物和C15H24的倍半萜烯β-石竹烯、β-甜没药烯、β-金合欢烯。D-柠檬烯具有令人愉快的、新鲜柠檬果香，是柑橘类水果中主要香气物质组分，它的相对含量在‘阳光’佛手柑样品中占比最高，对佛手柑的整体香气有着重要贡献，γ-松油烯通常与α-松油烯组成混合物共同存在，具有柑橘柠檬的香气以及草本植物的青香，是所有香气组分中含量较高的一个挥发性物质。D-柠檬烯与γ-松油烯的相对含量占比较高，这一结果与其他学者的研究相符[3-6]，通常D-柠檬烯在柑橘类植物果实中含量在50%～60%[16]，而本试验中其相对含量低于50%，这可能与佛手柑的保存时间较长、储藏温度较低有关。具有草青香的β-罗勒烯、柑橘果香和松木样青香的异松油烯，具有淡弱的香膏香脂气息的月桂烯以及辛甜暖甜的β-石竹烯这些成分的百分含量占比结果与Wu 等[17]、Singh 等[18]等基本相符。可见较多的萜烯类组分都具有柑橘柠檬样的果香、甜花香以及草本、松木样的青香香气，一些辛香、脂香气多起修饰作用。

表3 ‘阳光’佛手柑香气成分以及相对含量Table 3 Aroma components and relative contents of ‘Sunshine’ finger citron

2.1.2 醛类化合物

检测到的醛类香气化合物占检出香气组分总量的4.15%，分别为柠檬醛（2.34%）、(Z)-柠檬醛（1.34%）以及相对含量小于1%的香茅醛、正壬醛、枯茗醛。两种柠檬醛通常以混合体的形式共同存在，具有强烈的、似柠檬水果糖的柠檬果香。柠檬醛在一些柠檬样香气的天然精油中含量大于70%，是柑橘类香气组成中的重要成分之一。香茅醛和正壬醛的香气都是偏向花香香韵的果香，香茅醛具有香茅和玫瑰花香和柑橘柠檬样果香，而正壬醛C9醛有点脂肪感和皂感香气，稀释后有柑橘果香和偏向花朵叶子的青香，C8～C10的直链结构是脂肪醛化合物中的代表原料，Xu 等[19]比较了来自四种产地的佛手柑香气成分差异，发现正壬醛仅在浙江产地的金佛手中检测到，这也为浙江金佛手具有偏青香、接近柑橘皮的特征香气提供依据。枯茗醛为C10的脂肪醛，醛香较强并带有枯茗的特征草青香，虽然含量较小，但可以和草青香气的萜烯类化合物共同协调。

2.1.3 醇类化合物

检测到的醇类化合物占检出香气组分总量的2.32%，分别为α-松油醇（1.02%），以及相对含量在0.25%～0.36%之间的4-松油醇、桉叶油醇、橙花醇和香叶醇，这些醇类化合物的分子式均为C10H18O。α-松油醇与4-松油醇是一对同分异构体，都具有似松节油的油脂气和松木样青香，羟基位置的不同使α-松油醇带有似丁香花的花香，而4-松油烯醇则带有木香、胡椒样的辛香以及壤香。橙花醇和香叶醇也是一对Z 型和E 型的异构体，都拥有玫瑰花的蜜甜花香，但橙花醇的香气更加温和柔美，带有清新的柑橘、柠檬样香气。醇类化合物组分虽然相对含量不高，它们具有的松木青香、玫瑰花香和辛香却能同萜烯类化合物具有的对应香气，从而在香气上很好地融合，丰富和增强整体香气。其余醇类化合物使佛手柑的整体香气富有松木和草本植物青香。

2.1.4 芳香族化合物

4-异丙烯基甲苯、苯酚、苯甲酸、对伞花烃为检测到的芳香族化合物，总含量达2.95%，苯酚香气不强烈，且苯甲酸多是无味或稍带脂香，它们对‘阳光’佛手柑的香气贡献较少。含量占比大于1%的4-异丙烯基甲苯具有柑橘果香和类似愈创木酚的暖辛香，而对伞花烃具有新鲜的柑橘柠檬样果香，因其分子结构中含有苯环，别名为4-异丙基甲苯，因此既可当作单萜烯类化合物也可视为芳香族化合物。对伞花烃一般由D-柠檬烯转变而来，常在柑橘类精油的香气组分中出现，柠檬烯的结构不如有苯环稳定，易受空气的氧化而变构，最终形成对伞花烃。

2.1.5 酮类化合物

酮类化合物仅有相对含量值为0.93 μg/L 的β-紫罗兰酮，相对含量占总含量的0.07%，它拥有紫罗兰的花香以及甜香，β位的取代基同α位相比，使紫罗兰花香中带点木香，β-紫罗兰酮虽然含量较少，但可能会与香叶醇、香茅醛、橙花醇这些带有花香的成分起协同作用，使花香香气更加醇甜。

2.2 ‘阳光’佛手柑特征香气成分的确定

通过查询各挥发性组分的香气描述[20]，初步推测‘阳光’佛手柑的香气特征主要有以下几类：柑橘果香、玫瑰花香、松木青香、淡脂香。为明确关键香气成分，结合OAV 法分析（表4）。GC-O 嗅闻所用的香气强度法分析一共发现18 种物质，其余挥发性组分气味强度值为0，表示未闻到任何气味。

由表4 可知，气味强度值最大的香气组分为D-柠檬烯和柠檬醛、香叶醇（强度值为4，表示能感受到强烈的气味），且它们的香气活力值分别为3 045、1 189、3 652；其次较大的组分有强度值为3 的月桂烯、γ-松油烯、β-罗勒烯以及对伞花烃，香气活力值分别为21 679、485、1 877、5 159；强度值为2 的香气组分较多，这些物质组分的嗅觉特征不太明显，如水芹烯与β-石竹烯，都是能感受到一点辛甜和通鼻的气息，无法很好地区别开来，强度值为1 的香气组分嗅觉感觉是稍微能感觉到香气，如α-蒎烯和α-松油醇，都带有似松节油的木青气和较重的油脂气，又如橙花醇和β-紫罗兰酮，都具有甜蜜的花香，因此只感觉熟悉却又无法确定是哪种香气化合物，气味强度值用1 表示能稍微感觉到香气。

表4 ‘阳光’佛手柑GC-O 嗅闻结果与OAVTable 4 The sniffering result of ‘Sunshine’ finger citron and OAV

结合各挥发性香气组分的气味强度值和香气活力值大小，发现月桂烯、柠檬醛、γ-松油烯、β-石竹烯与β-罗勒烯等物质的气味强度值与香气活力值不成正比，并不是香气活力值越大其气味强度就越大，这体现了嗅闻检测时嗅闻员对香气感受的偏差、检测方法的局限性以及样品新鲜程度的影响。因此，‘阳光’佛手柑特征的香气成分仍主要依靠香气活力值的大小来判断，主要为D-柠檬烯、柠檬醛、香叶醇、月桂烯、γ-松油烯、β-罗勒烯和对伞花烃，使‘阳光’佛手柑的整体香气富有柑橘柠檬样果香、甜蜜花香、木青气以及淡淡的香脂气。

2.3 感官评价结果

2.3.1 感官特性描述

定量描述分析法可以使研究者得到完整的样品感官描述，更清晰地区分不同品牌或生产来源的样品差异。郭明月等[14]采用QDA 法区分三款上市蓝莓果汁饮料的感官特性，感官描述词围绕果汁的色泽、气味和口感对其进行感官评价，最后通过感官强度的评分完成三款果汁的区分。

本试验通过嗅闻结果建立感官特性描述词，将佛手柑样品中各挥发性成分记录下的香气特征进行归类汇总后，最终确定以下6 个特性描述词：果香、花香、草木香、酸香和脂香，其中草木香又可以再细分为草青和木青香气，具体如表5 所示。

表5 ‘阳光’佛手柑的感官特性描述词及其定义Table 5 The lexicon description of sensory evaluation of ‘Sunshine’ finger citron and their definitions

2.3.2 感官特性强度的评定

2 位评价员按照建立好的感官特性描述词汇将恢复至室温的冷冻‘阳光’佛手柑果实掰开，并对其香气进行嗅闻评价，按照感官特性强度大小1～9 进行打分评价（见表6），并结合评分结果绘制‘阳光’佛手柑的香气轮廓图（见图1）。

表6 感官特性强度评分结果Table 6 The score results of sensory characteristic intensity

图1 ‘阳光’佛手柑的香气轮廓图Fig.1 Aroma component profile of ‘Sunshine’ finger citron

由图1 可以更直接地看出，‘阳光’佛手柑的主要香韵组成，按照每种香韵的强度，由大到小分别是果香、酸香、花香、草木香、脂香和辛香。尽管在表4 中脂香的月桂烯香气活力值比D-柠檬烯、柠檬醛这些特征柑橘柠檬样果香的香气物质OAV 数值还要高10 倍，且以往研究曾提到月桂烯的特征脂香表现为橘皮香气[21]，以及佛手果皮上的香气强度比果肉更大[5,7]，但本试验的感官评价中脂香香韵评分结果为1，表示几乎嗅闻不到，这可能是由于仅选择了嗅觉感受来评价掰开后佛手果实的感官特性强度，靠近橘皮的脂香气感受极弱。

此外，图1 结合表4 发现，柑橘柠檬样果香不仅在香气轮廓图中得分最高，嗅闻记录的气味强度值较大的组分（如柠檬醛、D-柠檬烯、香叶醇、对伞花烃和β-罗勒烯）也均有似柠檬的果香，可见嗅闻强度值较大的物质对整体香气的贡献程度也较大[8]。还有一点值得注意的是，将表4 和表6 结合比较后发现，评分较高的果香香韵所对应的香气成分它们的OAV 值均大于1 000，这也验证了OAV 值越大，对香气的贡献程度就越高[7]。

3 结论

采用HS-SPME 与GC-MS-O 联用技术对‘阳光’佛手柑的挥发性组分进行分离与鉴定，共鉴定出34 种香气成分，其中占比最高的是萜烯类化合物19 种，相对含量总和为90.49%，其次是醛类和醇类。根据QDA 建立嗅觉上的感官特性描述词，各香韵的相对强度由大到小依次是果香、酸香、花香、草木香、脂香和辛香，进一步验证了‘阳光’佛手柑的特征香气成分为D-柠檬烯、柠檬醛、香叶醇、对伞花烃、γ-松油烯、β-罗勒烯以及月桂烯，使‘阳光’佛手柑的整体香气富有柑橘柠檬果香、甜蜜花香、草木青香和淡淡脂香香气。

以往的研究中指出，当香气组分的香气活力值大于1 时，就可能对果实、饮料及其他食品整体香气的贡献程度和影响较大[22]，但香气活力值小于1 的物质组分不代表就没有作用，可能因为其相对含量的较高而对香气起到修饰和调和作用。由此可见，数据结果中香气活力值大于100 甚至大于1000 的组分对佛手柑香气的影响之大。

随着越来越多的研究者开始对风味物质的香气成分进行分析与研究，GC-MS-O 的方法得到了更广泛的运用，尤其是食品与饮料行业。GC-O 同GC-MS 相比，可以将分离得到的组分通过嗅闻检测方法来确定单个组分对整体香气的贡献程度，如今在食品风味的分析方面受到更大的重视[10]，运用感官评定的方法能对关键香气成分进行更好的判断，在今后的研究中感官评定可以从色、香、味多角度出发，使感官评定更加全面准确。