粪菌移植在治疗急性移植物抗宿主病中的作用

邵亮 郭智

异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)是多种血液系统恶性肿瘤及骨髓衰竭类疾病获得治愈的重要手段之一。移植物抗宿主病(GVHD)是其主要的并发症之一，严重影响患者的生存期及生活质量。其中，急性GVHD(aGVHD)发生在移植+100天内，其中胃肠道aGVHD(GI-aGVHD)是allo-HSCT后非复发死亡的主要原因之一[1]。因此，aGVHD尤其是GI-aGVHD的治疗迫在眉睫。近年来，粪菌移植(FMT)作为一种新兴的治疗手段已被尝试应用于多种疾病，其中包括治疗造血干细胞移植后的aGVHD。在《中国异基因造血干细胞移植治疗血液系统疾病专家共识Ⅲ——急性移植物抗宿主病(2020年版)》、《肠道微生态与造血干细胞移植相关性中国专家共识》等指南共识中均提到FMT作为治疗aGVHD的三线治疗手段[2-3]。相关研究表明，应用FMT在aGVHD的治疗中初步显示出令人鼓舞的临床相关结果，尤其在使用FMT治疗耐类固醇的aGVHD有一定疗效[4]。有很多研究显示肠道微生物群在GVHD的发病机制中发挥了重要的免疫调节作用[5]。本文将FMT在allo-HSCT后GI-aGVHD治疗中应用作一综述。

一、FMT概况

FMT是重建肠道微生态的有效方法,是将健康人体粪便制成合适的制剂递送到患者的肠道，以修复或重建患者肠道的菌群，治疗病原体感染、代谢等疾病。在恢复肠道微生态多样性方面，FMT被认为是很好的益生菌来源，且在难治性或复发性艰难梭菌感染中的疗效已明确[6]。FMT已被应用于消化系统疾病(如慢性乙型肝炎、炎症性肠病)[7]、神经精神类疾病(如Alzheimer’s病)[8]、血液系统疾病(如aGVHD)[9]、代谢综合征(如糖尿病)[10]、多重耐药菌(如产广谱β-内酰胺酶大肠杆菌、产碳青霉烯酶铜绿假单胞菌和耐万古霉素的粪肠球菌)[9]等疾病的治疗，证明了FMT的有效性。

二、aGVHD与肠道微生态

1.aGVHD概况

aGVHD在allo-HSCT患者中的发生率约为50%，其中中重度aGVHD发生率为13%～47%，主要临床表现为腹泻、四肢及躯干部皮肤红疹，严重者可出现腹痛和肠梗阻[1,11]。aGVHD主要累及皮肤(80%)、胃肠道(55%)和肝脏(50%)。aGVHD的发生机制主要为移植物中的T细胞被供者自身或受者抗原提呈细胞(APC)识别，继而发生激活、分化，并迁移至受者靶器官，包括胃肠道、肺脏、肝脏和皮肤，引起受者脏器损伤，甚至衰竭。移植预处理是aGVHD的始作俑者，放疗/化疗引起受者组织(如胃肠道黏膜、皮肤及肝脏)出现炎性损伤，释放大量炎症因子[如IL-1、IL-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α等]、损伤相关分子模式(DAMPs)、病原体相关分子模式(PAMPs)，同时还引起主要组织相容性复合体(MHC)抗原表达和共刺激分子增加，继而激活移植物中的供者T细胞，并进行分化、增殖，然后攻击受者靶器官[11]。《中国异基因造血干细胞移植治疗血液系统疾病专家共识Ⅲ——急性移植物抗宿主病(2020年版)》中aGVHD的一线治疗为糖皮质激素，常用甲泼尼龙；二线治疗包括IL-2受体单抗(巴利昔单抗)、甲氨蝶呤(MTX)、芦可替尼等；三线治疗包括抗人胸腺淋巴细胞球蛋白(ATG)、间充质干细胞(MSC)和FMT等。

2.肠道微生态概况

微生态是指特定环境或生态系统中的全部微生物，包括其细胞群体、数量和全部遗传物质(基因组)，它界定了涵盖微生物群及其全部遗传与生理功能，其内涵包括微生物与其环境和宿主的相互作用。健康人体表面和体内生活着超过100万亿的共生微生物，主要分布在人体的胃肠道、口腔、呼吸道、泌尿生殖道等部位。健康人微生物菌群，特别是肠道菌群，被认为是一个“必要的器官”，其携带的基因组比整个人类基因组高出约150倍。生理条件下，肠道微生物是一群高度多样化的非致病共生菌，主要包括拟杆菌(Bacteroidetes)、厚壁菌(phylum Firmicutes)、放线菌(Actinobacteria)及变形菌(Proteobacteria)[12]。其中，小肠中有约1 000种微生物种，以厚壁菌和拟杆菌为主，约占90%；其次为放线菌、变形菌、疣微菌和梭杆菌。健康人粪便中的微生物密度高达1013～1014个细胞/g。

3.aGVHD与肠道微生态

接受allo-HSCT的患者，由于移植前的放疗/化疗导致肠道破坏，易发生菌群失调。Allo-HSCT后患者呈现出肠道微生物多样化的丧失及微生物组成的改变，这一现象在发生aGVHD患者中尤为突出。Taur等[13]根据移植后受者肠道菌群的水平将人群分为低、中、高多样化3组，3组患者的3年总生存率(OS率)分别为36%、60%和67%(P=0.019)；3年移植相关死亡率(TRM)分别为53%、23%和9%。一项纳入了1 362例allo-HSCT患者的大样本量研究显示，患者菌群多样化程度越高，其死亡率越低；多样化程度越低，GVHD相关死亡率越高[14]。Allo-HSCT过程中的肠道菌群失调可表现为菌群组成的改变。其中，乳杆菌(Lactobacillales)、葡萄球菌(Staphylococcaceae)、肠杆菌(Enterobacteriales)和巴斯德氏菌(Pasteurellales)在aGVHD患者中扩增最显著[15]。相关研究表明，肠球菌的扩增增加了aGVHD的严重度和死亡率，而乳酸杆菌的作用目前仍存在争议[15]。Taur等报道肠杆菌的富集与GVHD相关的死亡率呈正相关[13]。巴斯德氏菌可见于发生GI-aGVHD的儿童患者，并与其腹泻的严重程度密切相关[16]。相反，梭菌(Clostridiales)、拟杆菌(Bacteroidetes)和放线菌(Actinomycetaceae)在aGVHD患者中则明显减少[17-18]。Sofi等[19]发现，小肠菌群中拟杆菌的增加与GVHD的改善密切相关，且给予脆弱拟杆菌治疗后，增加了肠道的菌群多样化，进而增加了短链脂肪酸(SCFA)、IL-22和调节性T细胞(Tregs)水平，减轻了GVHD。

4.肠道微生物群在aGVHD发病机制中的作用

肠道菌群在GVHD的病理生理过程中发挥重要作用，造血干细胞移植会对机体肠道微生态产生影响，而肠道微生态可能也会通过多种机制影响造血干细胞移植的预后。移植过程中，由于预处理化疗强度大及使用预防性抗生素，会改变机体原有肠道菌群的构成，发生肠道共生菌减少、菌群多样性降低，造成微生态失衡或菌群易位，从而使肠道菌群的多样性和稳定性遭到破坏，造成肠道原有菌群失衡或菌群易位，甚至出现细菌肠道支配。肠道菌群中占支配地位的细菌包括短链脂肪酸的产生菌和专门发酵寡糖的菌种如双歧杆菌等，肠道内各种微生物群的定植或易位常先于感染发生，是引起菌血症和脓毒血症的常见原因之一。肠道菌群在肠道稳态和免疫调节中的作用至关重要，已为接受allo-HSCT患者临床结局的预测指标，肠道菌群变化可能决定了GVHD的严重程度，移植后可改变肠道菌群的组成从而引发菌群失调，肠道微生物易穿透受损的肠黏膜，引起异常免疫反应，活化了T淋巴细胞，促进炎症介质释放，造成胃肠黏膜屏障受损，从而损伤胃肠道等靶器官[3，12]。

三、肠道微生物检测技术在aGVHD的应用

1.肠道微生物谱分析技术

微生物谱分析常用的技术是16S核糖体RNA(rRNA)测序和宏基因组测序，原位杂交和聚合酶链式反应(PCR)已用于鉴定和定量细菌，编码16S rRNA亚基的基因包含在不同细菌物种之间高度保守的区域和特定细菌物种独特的9个高变区域。可通过对这些可变区域进行测序来鉴别细菌群落。这种方法可鉴别出细菌分类群，但不能提供对细菌菌株的确切鉴定结果。细菌群落的分类识别需要参考数据库，可使用Mothur和QIIME之类的开源软件来分析16S rRNA测序数据。宏基因组测序可提供样品中所有遗传物质的无偏测序，提取的基因组DNA(gDNA)经过大规模平行测序，可广泛覆盖微生物群落。由于序列覆盖率高，宏基因组测序可检测到丰度极低的微生物。微生物宏基因组测序和代谢组学谱分析是了解宿主中分类群水平变化与代谢功能之间相关性的重要工具[20]。

2.GVHD后微生物群改变的生物标记

allo-HSCT后出现GVHD或疾病复发时微生物群会发生改变，建议检测一种或多种细菌丰度变化[如布劳特代菌属和粘液真杆菌(E.limosum)]。另外，一些临床报告表明，岩藻糖基转移酶2(FUT2)的基因分型可作为allo-HSCT后出现GVHD和菌血症的生物标记[21]。FUT2基因型可能通过肠道表面蛋白和宿主微生物群的糖基化改变影响克罗恩病的发病风险。此外，梭状芽胞杆菌产生的尿代谢产物3-吲哚酚硫酸盐是肠道菌群健康的另一个潜在生物标志物，是肠道GVHD发生率降低和患者生存率提高的一项预后指标，也与肠道炎症减轻相关[22]。考虑到3-吲哚基硫酸盐水平检测试验的快速性，有可能被用于评估患者微生物群的健康状况，其临床意义是评估GVHD期间受损微生物群的恢复情况。

3.其他检测技术

肠道菌群变化可作为GVHD的非侵入性生物标志物。除16S rRNA测序和宏基因组测序技术外，实时荧光定量(qPCR)作为技术工具也可提供有关菌群相对丰度和动力学有价值的信息[23]。在临床尤其是在高危患者中，qPCR可用于allo-HSCT之前、之中和之后特定微生物菌株的实时监测。肠道微生物群损伤的研究也支持使用窄谱抗生素代替广谱抗生素，因广谱抗生素会对肠道黏膜产生更多附带损害，促进耐药微生物菌株出现。因此需要对肠道内某些菌群进行靶向治疗。这种靶向治疗的一个例子是将病原体特异性抗体与抗生素耦联。特定的病原体也可通过使用CRISPR-Cas9噬菌体来靶向治疗。在抗定植方面，基因工程细菌可用于与病原体竞争，肠道AMPs和Toll样受体的配体或药理化合物可帮助减少肠道致病微生物的定植，随后降低GVHD的发生风险。在高通量培养技术方面，目前已使用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术确定全球微生物组成，但该技术会遗漏不可培养的微生物。其他体外系统，如干细胞源性肠道上皮细胞与微生物组的共培养，可能有助于研究微生物培养物与人肠道细胞的相互作用[24]。

4.肠道微生物群与免疫重建及随访

肠道微生物群在免疫稳态中的作用提示肠道菌群可能影响allo-HSCT后免疫重建，并可能成为监测指标以调整移植后的免疫相关策略。据报道无菌小鼠造血功能有缺陷，提示肠道菌群可促进稳态骨髓细胞的发育并增加向粒细胞的分化潜能[25]。肠道菌群如何通过骨髓等远处部位控制免疫反应仍有待充分揭示。同系小鼠移植模型表明在抗生素治疗的移植受体，免疫重建发生延迟，提示微生物群的变化对allo-HSCT受体造血和免疫重建有影响。由于肠道微生物群具有调节宿主免疫力并在GVHD发生中发挥潜在作用，且与GVHD严重程度有关，因此肠道微生物群改变的有关指标可能成为重要的治疗随访标准。肠道微生物负荷的增加，如大肠杆菌的丰度增加，可能预示发生菌血症的风险增加。在allo-HSCT患者中监测肠道肠杆菌科菌株(如大肠杆菌、克雷伯菌属和肠杆菌)，可识别有感染风险的患者，可能减少肠杆菌科菌血症风险。微生物群与宿主免疫的相互作用可产生长期影响，亦可用于识别有疾病复发风险的患者[26]。

四、FMT在治疗aGVHD中的临床应用

2016年日本学者Kakihana等[27]首次应用FMT治疗糖皮质激素抵抗/耐药的aGVHD，结果显示所有患者(4例)均对FMT的治疗有反应，其中3例达到完全缓解(CR)，1例部分缓解(PR)，对激素抵抗的患者均在几天内出现胃肠道症状的改善；治疗过程中未观察到严重的不良反应；对FMT治疗有反应者，Tregs数量明显增加。该研究虽纳入的患者数量有限，但为FMT在GI-aGVHD的治疗开启了先河。随后，澳大利亚学者Spindelboeck等[28]对9例难治的重度GI-aGVHD患者进行研究，发现4例患者对FMT的治疗有反应，且取得明显生存获益。该研究还发现，同时使用抗生素是FMT治疗失败的主要因素，其使用明显阻碍了提供粪便的健康者微生物菌落谱在FMT治疗者体内的建立；而对于FMT治疗有反应者，FMT治疗后体内的微生物菌落谱与粪便提供者体内几乎一致。且对FMT治疗有反应者体内CD8+T淋巴细胞和Th17细胞水平均明显降低至接近正常人水平，而Tregs和天然淋巴细胞3(ILC3)水平均明显增加；对FMT治疗无反应者则趋势相反。该研究提示FMT治疗GI-aGVHD的可能机制为修复了患者肠道的菌群多样性，同时可能改变患者的免疫状态。

我国学者Qi等[29]采用中国粪菌库治疗了8例激素耐药的GI-aGVHD患者,结果显示所有患者在接受第1次FMT后临床症状均得到缓解。2周后2例患者腹泻完全停止，5例患者腹痛完全缓解。既往有研究对受者体内的菌群进行分析，发现FMT治疗前患者体内菌群的多样化减少，且厚壁菌与变形菌的比例失衡，拟杆菌的比例减少；FMT治疗后1周，患者体内拟杆菌(Bacteroidetes)、疣微菌(Ruminococcaceae)和脱硫弧菌(Desulfovibrionaceae)水平升高。FMT后有益的菌种，如拟杆菌属占主导地位，且FMT组90天无进展生存期(PFS)明显优于未接受FMT治疗组，但两组OS比较差异无统计学意义。整个治疗过程未发现严重的FMT相关的不良反应。

Zhao等[30]发起一项纳入41例使用FMT治疗激素耐药的GI-GVHD患者的非随机、开放的、Ⅰ/Ⅱ期临床研究，其中23例Ⅳ度GI-GVHD激素耐药患者接受FMT治疗(FMT治疗组)，另18例患者作为对照组,结果显示FMT治疗后第14天和第21天，FMT治疗组的临床症状缓解率明显高于对照组；随访90天，FMT治疗组较对照组有更好的OS；研究结束时，两组平均生存时间两组分别为>539天和107天，且FMT治疗组的无病生存率(EFS)和OS明显优于对照组。该研究没有发现与FMT明显相关的不良反应。Shouval等[31]首次报道了口服胶囊途径应用FMT治疗的7例激素耐药/依赖GI-aGVHD患者，结果显示2例患者达到CR，其肠道菌群的多样化得到改善。该研究说明口服胶囊安全有效。

以上研究结果均表明，FMT在治疗GI-aGVHD中安全性较好，主要通过提高患者肠道菌群的多样性和改变菌群组成达到治疗作用。那么FMT能否与其他治疗联用呢？Liu等[32]尝试联合FMT和芦可替尼挽救性治疗21例allo-HSCT后发生激素耐药的Ⅲ～Ⅳ度GI-aGVHD患者，结果显示治疗第28天的客观缓解率(ORR)为71.4%，其中10例患者获得CR；第56天的持续的总有效率(DOR)为80%；有反应的患者GVHD复发率为33.3%。该研究发现接受FMT治疗后，患者的菌群多态性明显提高。联合治疗的主要不良反应为病毒再激活(61.9%)和重度血细胞减少(81.0%)。预估的6个月OS率为57.1%，EFS为52.4%。以上数据均说明FMT联合芦可替尼可应用于临床治疗激素耐药的GI-aGVHD。

五、FMT的治疗流程和方法

1.供者的筛选

参照欧洲粪菌移植临床应用和操作共识报告[33],在选择供者时需要符合下列所有条件：(1)药物使用：近3个月未接受抗生素治疗、免疫抑制剂治疗或化疗；近期未使用质子泵抑制剂(PPI)治疗；(2)感染性疾病：无HIV、HBV、丙型肝炎病毒(HCV)、戊型肝炎病毒(HEV)、结核病史及暴露史；无尚未完全控制的系统性感染；未服用违禁药物如毒品等；未接受过组织或器官移植；1年内未接受过输血；无近期感染寄生虫和诺如病毒、鞭毛虫等；近6个月未接受有传染风险的减毒活疫苗；(3)消化道、内分泌及神经系统疾病方面：无炎症性肠病、肠易激综合征、慢性功能性便秘及其他慢性肠道功能紊乱；无肠道受累的慢性系统性自身免疫性疾病；无消化道肿瘤和息肉病史；近期无腹泻和便血；无神经系统疾病及神经退行性病变病史；无心理疾病；BMI≤25 kg/m2。

2.供者的血清学和粪便筛查项目

建议常规血清学检查包括：(1)各种常见的病毒筛查如巨细胞病毒(CMV)、EB病毒(EBV)、甲型肝炎病毒(HAV)、HBV、HCV、HEV、HIV、梅毒；(2)血常规、C反应蛋白、红细胞沉降率、肝肾功能、糖电解质等。常规粪便检查包括：(1)各种致病菌筛查：艰难梭菌、沙门菌、志贺氏菌、弯曲杆菌、O157 H7大肠杆菌、耶尔森菌、万古霉素抗药性肠球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、革兰氏阴性多药耐药菌等；(2)病毒筛查：如诺如病毒等；(3)寄生虫筛查：贾第鞭毛虫、隐孢子虫、人芽囊原虫、蠕虫等；(4)粪便隐血检查。

3.粪菌物制备要点

新鲜粪菌物制备要点：(1)新鲜粪便须在排便后6小时内使用；(2)为保证细菌的完整性，制备时间应尽可能简短；(3)尽可能使用厌氧储存和加工；(4)至少需要30 g大便的量；(5)需使用搅拌器/搅拌棒将粪便重悬于生理盐水，搅拌后通过滤网滤掉残渣和小颗粒物质，以免输入时堵塞注射器和管道;(6)制备过程中需戴保护性手套和面屏；(7)制备场所在粪菌物制备前后均需经严格消毒，以免细菌外溢。冷冻粪菌物制备要点：(1)新鲜粪便至少30 g加入150 ml生理盐水；(2)冰冻前应加入甘油，使得甘油终浓度为10%；(3)最终获得的粪菌悬液应详细标记，冻存于-80 ℃；(4)回输当天，粪菌储存液应放置37 ℃水浴箱解冻，解冻后6小时内输注；(5)解冻后可适当加入生理盐水，以达到预期的浓度；(6)尽量避免反复冻融。

4.输入途径及安全性

FMT治疗过程输入途径如下：(1)上消化道途径：主要通过胃镜等回输，缺点是输入的粪菌悬液量相对较少；如需回输500 ml，则需要置鼻空肠管；(2)结肠镜途径：粪菌悬液通过结肠镜注入；(3)灌肠途径：适用于无法使用结肠镜的虚弱患者；(4)口服胶囊。FMT的不良反应包括：(1)短期不良反应：与FMT的输入途径和受者的基础情况有关，如发热、腹泻、腹胀、腹部痉挛、便秘、呕吐等；(2)潜在的长期不良反应：与FMT可能相关的肥胖、外周神经炎、Sjögren’s综合征、原发免疫性血小板减少症(ITP)、内风湿性关节炎等。

六、展望

FMT在治疗allo-HSCT后激素耐药的GI-aGVHD已初显疗效，其主要作用机制可能包括：(1)恢复患者肠道菌群的多样化；(2)修复患者肠道菌群的组成；(3)改变机体的免疫状态。目前国内外的临床数据均显示FMT的不良反应较小，且基本可控，说明其安全性尚可。总而言之，FMT治疗GVHD具有远大应用前景，到目前为止FMT的疗效令人鼓舞，严重不良事件很少，如能得到随机临床试验的证实，相信使用FMT可成为治疗类固醇难治性或依赖性aGVHD的标准方案，将来FMT可能不仅局限于类固醇难治性或依赖性患者，会更广泛地应用于aGVHD患者，或成为一线治疗或预防治疗措施。此外，每一个接受allo-HSCT的患者都会进行肠道微生物群分析，FMT可用于重建肠道微生物群，增加肠道屏障的完整性，仅此一点就足以预防aGVHD和慢性GVHD。当然，更多的结论还需要更多的随机临床试验证据支持。