雄激素对乳腺癌细胞增殖的影响

陈月 徐丹

(1北华大学，吉林 吉林 132011；2北华大学附属医院)

乳腺癌是全球女性癌症死亡的主要原因〔1〕。在全球161个国家中，乳腺癌居女性癌症发病率和死亡率的首位，同样居于我国女性恶性肿瘤发病率首位〔2〕。乳腺癌是一种高度异质性的雌激素依赖性恶性肿瘤，发病率逐年增高，据中国肿瘤登记中心发布的数据显示，中国女性每年新发乳腺癌约24.9万例，位居城市女性恶性肿瘤的首位〔3〕。性激素在乳腺癌的发生和发展中扮演着重要角色，有研究表明，增加女性接触卵巢激素的因素同样也会增加其患乳腺癌的风险〔4〕。而激素致癌的机制实际上就是细胞增殖的增加，从而增加了基因突变累积的机会〔5〕。初潮年龄早、未生育及绝经年龄晚都会增加患乳腺癌的风险〔6〕，此外，激素的替代疗法也会增加患乳腺癌的风险〔7〕，而母乳喂养和生育期则具有保护作用。尽管流行病学研究强烈支持雌激素在绝经后乳腺癌中的病因学作用，但雌激素在绝经前乳腺癌中的作用尚不清楚〔8〕。

雌激素同样在乳腺癌的发生和发展中也扮演着重要的角色，其中终生接触雌激素的增加或许是许多乳腺癌发生发展危险因素中最有依据的解释。乳腺癌的发生与内源性类固醇有关〔9〕。乳房是对雌激素敏感的器官〔1〕，雌激素可以促进乳腺肿瘤的发展和生长〔10〕。雌二醇(E2)，是由雌酮(E1)的还原和(或)睾酮(T)的芳构化形成的〔11〕。雄激素由卵巢和肾上腺分泌，它们构成了女性一生中占主导地位的性类固醇激素，雄激素可以作为雌激素前体，它们还可以通过与大多数乳腺癌标本中存在的雄激素受体结合来直接作用于乳腺癌细胞〔12〕。雄激素种类较多，如T、双氢睾酮(DHT)及脱氢表雄酮等，具有生物活性的主要为T和DHT〔13〕。研究表明，T通过其两种活性代谢物之间的平衡相互作用控制乳腺上皮生长：E2促进细胞增殖，而DHT抑制细胞增殖〔14〕。雄激素作为调节机体正常活动的重要物质，具有多种重要的生物学功能，其表达与乳腺癌有着密切的联系。虽然雌激素在乳腺癌病因学中的作用已被证实，但雄激素在乳腺癌发展和进展中的作用尚不清楚。目前的理论认为雄激素可以抑制乳腺癌细胞的生长，这种作用是通过雄激素受体所介导的〔15〕。目前，国内外针对雄激素在不同浓度对乳腺癌细胞的增殖是抑制还是促进、在不同浓度雄激素环境下是否可以抑制乳腺癌细胞的增殖之间的关系研究鲜有报道。而许多关于雄激素对乳腺癌影响的体外研究都是在低浓度雌激素的存在下进行的，这使结果的解释复杂化了。本研究中，给予的条件是在严重缺乏雌激素的情况下，雄激素对乳腺癌细胞增殖的影响。在这样的条件下检查雄激素的作用可能更加具有临床意义。本文对不同浓度下雄激素对乳腺癌细胞增殖的影响进行研究。

1 材料与方法

1.1细胞培养 MCF-7细胞购自美国标准生物品收藏中心(ATCC)，在DMEM低糖培养基中添加10%胎牛血清(FBS)培养于37℃、95%空气和5%CO2培养箱。细胞培养液在添加到细胞培养基之前，通过用2%葡聚糖包被的活性炭(Sigma，St.Louis，MO，USA)处理FBS并在4℃过夜，消除血清中的外源性激素。

1.2不同浓度雄激素的制备 选用T及DHT粉末，根据其分子量，首先溶解于二甲基亚砜(DMSO)中配备1个高浓度备用，再用无水乙醇稀释到所需的不同浓度。DHT浓度分别为：0.0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 nmol/L。T浓度分别为：0.0、0.4、0.8、1.2、2.0 nmol/L，待需要时加入培养孔中。

1.3细胞增殖 通过CyQuant细胞增殖试剂盒(Molecular Probe，Eugene，OR，USA)测定细胞增殖。将MCF-7细胞(3×103)接种到含有100 μl活性炭处理的无激素培养基的96 孔板上，48 h后分别给予0.0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 nmol/L浓度的DHT及0.0、0.4、0.8、1.2、2.0 nmol/L浓度T加入培养液中，每组设5个复孔，加入0.0 nmol/L DHT及加入0.0 nmol/L T的细胞被认定为无激素组。细胞培养基每2 d更换一半。第4天，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤板并在-80℃下冷冻。

通过CyQuant细胞增殖试剂盒确定细胞增殖测定培养板在室温下解冻，在避光条件下在每孔中加入200 μl的 CYQUANT GR染料/细胞裂解缓冲液添加到每个孔中，然后轻轻混合，室温条件下孵育2～5 min。在使用装有基于Excel的细胞增殖软件的 Genios Plus(激发光480 nm，发射光520 nm)中读板。

1.4细胞活力测定 通过使用噻唑蓝(MTT)测定细胞活力。将3×103个细胞接种在96孔板中并孵育24 h。然后分别加入浓度为0.0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 nmol/L DHT及0.0、0.4、0.8、1.2、2.0 nmol/L浓度T一起孵育。处理4 d后，每孔加入10 μl MTT试剂，将细胞在37℃下孵育2～4 h，直至出现紫色沉淀，然后加入100 μl洗涤试剂。将板在室温下在黑暗中放置过夜，并使用读板器在570 nm处记录吸光度。

1.5统计学方法 采用SPSS26.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1雄激素对细胞增殖表达的影响 DHT 0.0 nmol/L组和T 0.0 nmol/L组为无激素影响对照，加入不同浓度DHT和T均对细胞增殖有影响。随着雄激素浓度升高细胞增殖也随之变化， DHT 0.8、1.2、1.6、2.0 nmol/L组与DHT 0.0 nmol/L组差异均具有统计学意义(P<0.05)， DHT 1.6 nmol/L组DNA浓度表达量最低，抑制作用最明显。T 2.0 nmol/L组DNA浓度与T 0.0 nmol/L组相比差异有统计学意义(P<0.05)，提示随着T浓度的升高,T抑制细胞增殖的作用更加明显。见表1、表2。

2.2雄激素对细胞活力表达的影响 DHT 1.6 nmol/L组细胞活力较DHT 0.0 nmol/L组显著下降 (P<0.05)，且吸光度最低。T 0.4、0.8、1.2、2.0 nmol/L组细胞活力与T 0.0 nmol/L组相比差异均有统计学意义(P<0.05)，T 2.0 nmol/L组吸光度值最低，表明雄激素发挥的抑制作用最明显。见表1、表2。

表1 DHT对细胞增殖及细胞活力表达的影响

表2 T对细胞增殖及细胞活力表达的影响

3 讨 论

雄激素是人体内必不可少的一种性激素，属于类固醇激素，是人体内生物活性的蛋白质，一般是指男性睾丸所产生的激素，而女性体内的雄激素则主要是卵巢和肾上腺皮质分泌，绝经前女性体内的五种主要雄激素(根据血清浓度降序排列)分别是硫酸脱氢表雄酮(DHEAS)、脱氢表雄酮(DHEA)、雄烯二酮、T和DHT〔16〕。DHEAS仅由肾上腺产生〔17〕，而DHEA则是通过硫酸酯酶(30%)将DHEAS外周转化，在肾上腺(50%)、卵巢(20%)和其他地方产生〔18〕雄烯二酮由卵巢和肾上腺等量产生的。大约一半的T来自雄烯二酮的外周转化，剩下的一半由肾上腺和卵巢合成。在绝经前妇女中，雌激素来自卵巢和脂肪组织，在黄体期产生的卵巢雌激素相对多于卵泡期〔19，20〕。E2是绝经前妇女循环雌激素的主要类型，主要由卵巢分泌〔21〕。雄激素其主要通过与雄激素受体结合而发挥作用，其主要功能是促进性器官的生长发育和第二性征出现，维持正常生殖功能。雄激素在调节女性生殖功能中也起着重要的作用，它们对卵巢功能和生育能力具有协调作用，对颗粒细胞和卵母细胞的刺激有利于卵泡发育〔22，23〕及在调节卵泡成熟的所有阶段都是必不可少的〔24〕。其中在乳房和其他组织中芳构化成E2和E1，成为雌激素的重要来源〔21，25〕。E1似乎是雌激素绝经后循环的主要形式。在一项对绝经后妇女的9项前瞻性研究的汇总分析中，Key等〔26〕报告了随着循环性激素水平(包括E2、硫酸雌酮、雄烯二酮、DHEA和T)的增加，乳腺癌的风险也在增加〔26〕。研究表明，循环雄激素水平，与乳腺癌风险增加有关，雄激素可直接通过促进细胞生长和增殖，或间接通过其芳构化成雌激素发挥作用。尽管雄激素有扩增的原因，但是雄激素在细胞增殖中也起着至关重要的作用〔27〕。对绝经后妇女的临床研究表明，乳腺癌的发病率与循环雄激素水平〔28～31〕及与E2和T水平升高呈正相关〔29，32〕。

本研究结果表明，不同浓度的雄激素对MCF-7乳腺癌细胞株的增殖作用有所不同，当DHT浓度为1.6 nmol/L时及T浓度为2.0 nmol/L时可明显抑制MCF-7乳腺癌细胞株的增殖。进一步分析发现，雄激素T和DHT在没有雌激素的情况下仍然可以诱导MCF-7细胞生长，并且乳腺癌细胞也能表现出较高的增殖现象。事实上，雄激素对乳腺细胞并非仅具有单一的抗增殖作用，可能是由于这几种机制导致雄激素对乳腺细胞增殖的影响，其中包括雄激素转化为DHT(5α-还原酶途径)，DHT的下游代谢产物为5α-3β二醇是由3β-羟类固醇脱氢酶(HSD)作用产生的〔33〕，3β二醇在乳腺癌细胞中具有雌激素作用，它能激活雌激素受体(ER)α诱导生长和ER信号所导致，或E2(芳香酶途径)、肾上腺雄激素(包括T和雄烯二酮)通过芳香化酶(CYP19)外周转化产生从而雌激素，或者是它们与雄激素受体(AR)和(或)ER结合，雄激素信号使用5α-还原酶途径，能够控制由AR介导的细胞增殖〔34〕。研究表明，缺乏雌激素的乳腺癌细胞上调了激素生成酶，并将雄激素代谢为雌激素样类固醇，而雌激素样类固醇的产生代表了对芳香化酶抑制剂的一种潜在的耐药性机制〔33〕。Omoto等〔35〕研究发现，当敲除雌性小鼠氧固醇7α羟化酶( CYP7B1，负责消除 3β二醇)时，小鼠乳腺和其他生殖组织表现出增殖升高及青春期早发和卵巢早衰，这更加印证了3β二醇在乳房和生殖组织中确实具有雌激素作用〔35〕。因此，可知雄激素信号在乳房稳态中起着至关重要的作用，它不仅可以抵消乳房中雌激素信号的增殖作用，而且当雄激素转化为雌激素(芳香酶途径)时，也会增加细胞增殖和乳腺癌发生的风险〔34〕。

综上，人体内雌雄激素代谢是一个复杂的通路，需要各种激素相互协同、拮抗起作用，虽然本研究可以看出雄激素在特定浓度下能够抑制乳腺癌细胞增殖，但仍无法明确将雄激素尤其是DHT确定为抑制乳腺癌细胞增殖的作用。