苗药五香血藤提取物对慢性非细菌性前列腺炎大鼠NF-κB P65、iNOS表达的影响

李章春 宁燕 李珀 梁子聪 杨政敏 孙海波

(1黔南民族医学高等专科学校，贵州 都匀 558000;2贵州医科大学)

慢性非细菌性前列腺炎(CAP)是临床男科前列腺炎最常见的类型，占发病率的90%以上〔1〕，全球发病率为3%～16%〔2〕，在我国约占成年男性泌尿科门诊疾病的33%〔3〕，患者临床表现为尿急、尿频、尿不尽等排尿异常，并伴随腰骶部等酸账不适，生活质量受到严重影响。然而，CAP的发病机制尚不十分明确，但免疫因素在CAP的发生与发展中发挥重要作用，已被众多研究所证实，由于老年人群机体免疫能力下降，且前列腺增生的高发进一步加重了治疗难度〔4〕。核因子(NF)-κB在免疫、炎症反应中具有重要的调节性作用，与细胞因子关系密切，已成为当前研究疾病发病机制的一个热点〔5〕。目前，CAP的治疗方法主要是α1-受体阻滞剂、抗生素、非甾体类抗炎药等，但此类药物易造成头晕、皮肤过敏、胃肠出血等不良反应，不宜长期服用，且治疗效果也并不理想〔6〕。中医药以疗效好，不良反应小的特点，逐渐成为CAP治疗药物研发的新方向〔7,8〕。五香血藤是贵州常用的民间苗药，具有抗肿瘤、消肿镇痛等功效〔9〕，但有关五香血藤治疗CAP的研究却鲜有报道，本文通过观察五香血藤提取物对CAP大鼠NF-κB P65、iNOS蛋白表达的影响，进一步探究其治疗CAP的作用机制。

1 材料与方法

1.1实验动物及分组 健康雄性成年SD大鼠60只，体重200～220 g，由长沙市天勤生物技术有限公司提供，许可证号：SCXK(湘)2019-0013。大鼠随机分为正常组，CAP模型组、阳性药物组、苗药五香血藤提取物高剂量治疗组(高剂量组)、中剂量治疗组(中剂量组)、低剂量治疗组(低剂量组)，每组10只，每笼5只，分笼饲养，自由取水、食，适应性喂养3 d。

1.2药物试剂与仪器 干五香血藤购自贵州都匀市中药材市场，广西师范大学化学与药学学院进行质控、鉴定和提取，方法：取五香血藤，粉碎，加入萃取釜中，80 L 80%的乙醇萃取3次，取浸膏备用；消痔灵注射液，国药准字Z22026175,吉林集安益盛药业股份有限公司；前列舒通胶囊，国药准字Z20027140，保定天浩制药有限公司。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-6和IL-8水平，试剂盒购自武汉纯度生物科技有限公司，全自动酶标仪：Mindrady MR-96A。

1.3模型制备 根据文献〔10〕方法，乙醚麻醉大鼠，仰位固定于消毒铺巾，在下腹正中部位行切口，提起膀胱，找到两侧前列腺，将25%消痔灵注射液分别注入前列腺背叶内，各0.1 ml,逐层进行缝合，模型形成期7 d，7 d后开始给药治疗。

1.4给药方法 参照文献〔11〕换算，阳性药物组给予前列舒通胶囊水溶液灌胃治疗，剂量20 ml/kg；苗药五香血藤提取物高、中、低剂量组分别给予252、126、63 mg/kg剂量灌胃；正常组和CAP模型组给予无菌生理盐水灌胃，剂量同阳性药物组，各组给药1次/d，连续给药28 d。

1.5实验取材 末次给药结束2 h后，称取各组大鼠重量，股动脉取血，静置，离心，取上清液备用。待处死大鼠后，置于操作台剪下膀胱及前列腺，剔除脂肪和膀胱，滤纸吸干，称重，同时取肝脏、脾脏、胸腺、肾脏等器官，并计算脏器指数(脏器指数=脏器质量/体重×100%)。

1.6标本处理 取大鼠前列腺组织，用4%的多聚甲醛进行固定，经常规的组织脱水、透明、浸泡、包埋、切片、脱蜡等处理，苏木素-伊红(HE)染色，光镜下病理组织观察分析。

1.7Western印迹检测前列腺组织NF-κB P65、iNOS蛋白表达 采用裂解法提取细胞总蛋白，冷磷酸盐缓冲液(PBS)将前列腺组织洗涤2～3次，细细剪碎组织置于匀浆管中，4℃ 12 000 r/min离心10 min，取上清液，二喹啉甲酸(BCA)法测定蛋白含量，各组取等量蛋白质经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)后转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜,封闭1 h，加入NF-κB P65(1∶1 000)、iNOS(1∶1 000)一抗，4℃孵育过夜，0.5%TBST溶液洗膜，5 min/次，共3次，加入二抗，室温下孵育30 min，0.5%TBST溶液洗膜，5 min/次，共3次，化学发光法显色，ImageJ软件分析灰度值，计算目标蛋白相对含量(即目的蛋白灰度值/β-actin内参蛋白灰度值)。

1.8统计学分析 采用SPSS22.0软件进行单因素方差分析。

2 结 果

2.1各组前列腺指数比较 给药结束后，与CAP模型组比较，除低剂量组外其余各组前列腺指数均明显降低(P<0.05)；高剂量组与阳性药物组差异性不显著(P>0.05)，两组前列腺指数逐渐接近正常组，见表1。

2.2各组前列腺组织NF-κB P65、iNOS蛋白相对表达量比较 与正常组比较，其余各组前列腺组织NF-κB P65、iNOS蛋白相对表达量均显著升高(P<0.05)；与CAP模型组比较，除低剂量组NF-κB p65蛋白相对表达量，其余各治疗组NF-κB P65、iNOS蛋白相对表达量均明显降低(P<0.05)；与阳性药物组比较，仅高剂量组与其差异性不显著(P>0.05)，见表1、图1。

2.3各组血清TNF-α、IL-6和IL-8含量比较 与CAP模型组比较，其余各组TNF-α、IL-6和IL-8含量均明显降低(P<0.05)，与阳性药物组比较，高剂量组血清TNF-α、IL-6和IL-8含量差异性不显著(P>0.05)，且两组含量逐渐接近正常组，见表1。

表1 各组前列腺指数、组织NF-κB P65、iNOS蛋白相对表达量及血清TNF-α、IL-6、IL-8含量比较

1～6:CAP模型组，低剂量组，中剂量组，高剂量组，阳性药物组，正常组图1 Western印迹检测前列腺组织NF-κB P65、iNOS蛋白表达

2.4各组肝、脾、肾脏器指数比较 与CAP模型组比较，阳性药物组和高剂量组的肝脏指数和肾脏指数差异性显著(P<0.05)，各组脾脏指数差异不显著(P>0.05)；与阳性药物组比较，高剂量组肝脏指数明显升高(P<0.05)，而脾脏指数和肾脏指数差异不显著(P>0.05)，见表2。

2.5各组前列腺组织病理学观察 镜下可见，正常组前列腺组织病理学观察未见异常改变；CAP模型组前列腺组织内腺体上皮细胞明显增生，间质内毛细血管充血，大量纤维组织增生，炎症细胞浸润明显；低剂量组前列腺组织内仍可见腺体上皮细胞增生及较多的炎症细胞浸润，但其增生及浸润的程度较模型组有所减轻；中剂量组前列腺组织的腺体轻度增生，间质内炎症细胞数量减少，纤维组织增生缓解，较低剂量组有所减轻；高剂量组前列腺组织的腺体上皮细胞排列整齐，无明显增生，纤维组织增生及炎症细胞渗出病变明显减轻，病理改变接近阳性药物组，见图2。

表2 各组脏器指数比较

正常组

CAP模型组

阳性药物组

高剂量组

中剂量组

低剂量组

3 讨 论

2016年，国务院颁发了《国务院关于印发中医药发展战略规划纲要(2016～2030年)的通知》(简称通知)〔12〕，强调要加强中医药科学研究，加强对常见病、多发病、慢性病的中医药防治研究，针对疾病新的药物靶标，在中药资源中寻找新的候选药物。近年来，在CAP的药物治疗中，中医药因具有双向调节、多靶点的特点，在减轻炎症、缓解患者盆腔疼痛中发挥了重要作用〔13〕。五香血藤属五味子科为木质藤本植物，具有理气止痛、活血消肿等功效，主要活性成分是木脂素，有抗氧化、解热、安定等作用，用于治疗无名肿毒、咽喉肿痛、跌打损伤等〔14〕，但目前有关五香血藤药物应用的基础医学研究还并不多见。本研究结果表明，五香血藤可能通过抑制NF-κB P65、iNOS蛋白表达，参与了CAP大鼠的炎症调解。

NF-κB是一种基因转录调控蛋白，在细胞发育、促增殖、炎症反应、肿瘤形成等免疫性疾病中具有广泛的调节作用，是重要的信号通路〔15〕。通常情况下，NF-κB在正常细胞中处于失活状态，它主要以p50/p65二聚体形式与其抑制蛋白(I-κB)结合，存在于胞质中，当细胞因子、活性氧等多种刺激，使I-κB被诱导磷酸化，p50/p65解离，使NF-κB活化，据研究显示〔16，17〕，p65能够与下游TNF-α、IL-6等靶基因结合，启动相关子区域，使这些基因的转录水平被提高。在NF-κB与前列腺癌的相关研究中发现〔18〕，在前列腺癌形成期间NF-κB表达水平逐渐增加，肿瘤一旦形成NF-κB会表现出过度活化现象，前列腺癌的发病与慢性前列腺炎具有高度相关性〔19〕。一氧化氮合酶分为nNOS、iNOS、eNOS 3种亚型，其中iNOS和一氧化氮(NO)是NF-κB信号通路中两种重要的信号转导分子，构成了机体重要的氧化应激通路，即NF-κB/iNOS-NO信号通路，与炎症损伤、氧化损伤关系十分密切，能够放大炎症反应级联，激活炎症介质趋化，使TNF-α、IL-1、IL-8等炎症细胞因子表达释放〔20，21〕。iNOS和前列腺炎的关系研究认为，氧化应激可能是Ⅲ型前列腺炎的重要发病因素之一〔22〕。本研究结果表明，五香血藤提取物能够对CAP大鼠炎症起到缓解作用。

综上，苗药五香血藤提取物能够对CAP大鼠前列腺组织内NF-κB P65、iNOS蛋白的表达起到抑制作用，通过下调TNF-α、IL-6和IL-8含量，改善组织学损伤，降低炎症水平。