基于RhoA/ROCK信号通路研究上调miR-19b对MSCs成骨分化的影响

陈顺玲 许和贵 朱旭 杨砥

(贵州中医药大学第一附属医院骨伤科，贵州 贵阳 550002)

骨质疏松是一种代谢性骨骼疾病，骨量减少、成骨细胞和破骨细胞失衡、骨组织结构破坏是该病的主要特征〔1〕，随着年龄的增长，女性逐渐进入绝经期，其体内性激素水平会急剧减少，钙调节激素分泌紊乱，微量元素不足，最后导致骨质疏松发生〔2〕。骨髓间充质干细胞(MSCs)具有较强的自我更新能力和定向分化作用，可在体外培养，在一定的条件下可分化为成骨细胞和软骨细胞，同时还具有免疫调节作用〔3〕，MSCs也是导致成骨细胞分化失衡的主要原因，MSCs成骨分化过程中细胞骨架会发生一系列变化，而Ras同源基因家族成员(Rho)A/Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶(ROCK)信号通路参与细胞骨架的调控过程〔4〕。本研究基于RhoA/ROCK信号通路研究上调miR-19b对MSCs成骨分化的影响。

1 资料与方法

1.1研究动物 选取清洁及健康雌性昆明大鼠36只，2～3月龄，平均(2.38±0.47)个月，体重250～300 g，平均(261.25±23.75)g，均为解放军总医院实验动物研究中心提供，许可批号：SCXK(粤)2020-0055。大鼠饲养环境为：温度27℃，湿度60%，饮水和饮食自由。

1.2骨质疏松大鼠模型建立 从清洁及健康的24只雌性大鼠中，随机选取6只分为正常组，剩余18只建立骨质疏松模型，参考文献〔5〕建立骨质疏松大鼠模型，先沿大鼠背部脊柱两侧剃毛，注射2% 40 mg/kg戊巴比妥钠腹腔麻醉，腹部正中间行纵向切口，寻找左边和右边末端的卵巢，行结扎切除手术，注射青霉素预防感染。

1.3MSCs培养 颈椎处死骨质疏松模型大鼠和正常组大鼠，将其置于75%乙醇中浸泡10 min，无菌环境下暴露大鼠后肢，然后切开其皮肤，沿着膝关节处剪开，取出多余的组织和韧带，再沿着大鼠髋关节和踝关节处剪切，随后取出大鼠胫骨和股骨，将胫骨和股骨浸泡在磷酸盐缓冲液(PBS)中，清洗3次，直至胫骨和股骨周围的组织全部去除，然后吸取培养基中5 ml的溶液，离心15 min，制作单细胞悬液，与4%乙酸混合，显微镜下计数，将细胞接种在50 cm2的培养基中，显微镜下观察细胞生长形态。

1.4碱性磷酸酶、茜素红染色 将5 mmol/L维生素C、10 mmol/L β-甘油磷酸钠、100 nmol/L地塞米松、10%胎牛血清(FBS)用改良爱德华培养基(MEM)在无菌条件下稀释至10 ml，混合4℃保存。细胞生长到融合状态进行消化传代，将第三代细胞在6孔板中接种，当细胞铺满瓶底80%将培养液吸出，7 d后进行碱性磷酸酶染色在室温环境下进行，需要避光染色15 min，14 d后进行茜素红染色，在37℃环境中孵育30 min。

1.5分组 将18只骨质疏松模型大鼠分为模型组、空白组和上调组各6只，模型组和空白组给予等体积的生理盐水进行干预，空白组将5 μl的慢病毒注射到大鼠体内，为无意义序列，上调组在大鼠体内注射5 μl的miR-19b慢病毒，慢病毒引物序列为：上游：5′-ACTGAGCGATGAGCAGGC-3′，下游5′-CTTCGGGCCAGTAACGTTAGGG-3′，连续干预2 w。

1.6检测miR-19b表达量 聚合酶链反应检测miR-19b表达量，取MSCs细胞以1×105个/ml的密度接种于6孔板，每孔2 ml，72 h后Trizol法提取总RNA，并逆转录cDNA，用95℃无RNA酶水洗脱出miR-19b，PCR循环参数设定为95℃ 10 min，然后90℃ 15 min，60℃ 1 min，共40个循环，最后使用2-ΔΔCt法检测miR-19b表达量。

1.7成骨细胞、信号通路相关蛋白检测 采用Western印迹检测特异性转录因子(OSX)、骨黏连蛋白(OSN)、骨桥蛋白(OPN)、RhoA、ROCK蛋白表达量，实验步骤：将MSCs细胞接种于6孔板中，24 h贴壁后各组进行处理，将采集到的样本研磨加入蛋白缓冲液，提取各组细胞蛋白并使用二喹啉甲酸(BCA)法测定浓度，制备电泳样品，上样量50 μg进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，蛋白转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，加入脱脂奶粉封闭1 h，一抗(1∶1 000)4℃ 孵育过夜，洗膜5 min/次，共3次，二抗(1∶4 000)室温孵育1 h，洗膜5 min/次，共3次，加入发光液曝光3～4次，取重叠值。采用软件分析蛋白条带灰度值，内参蛋白为GAPDH。

1.8统计学处理 采用SPSS20.0软件进行齐性方差检验、独立样本t检验。

2 结 果

2.1成骨细胞形态学观察 如图1所示，在显微镜下观察发现，分离出来的原代成骨细胞贴壁生长，多为边形或者梭形，仅有一小部分细胞的表面可见细小的突起，与邻近的细胞相连接；培养出来的第三代细胞系生长较快，大多数细胞呈棱形或者锥形。

图1 成骨细胞形态学观察(×200)

2.2miR-19b在各组中的表达水平 如表1所示，与正常组相比，模型组、空白组、上调组miR-19b表达量明显降低(P<0.05)；与模型组相比，空白组、上调组miR-19b表达量明显升高(P<0.05)；与空白组相比，上调组miR-19b表达量明显升高(P<0.05)。

2.3miR-19b对成骨细胞相关蛋白的影响 如表1所示，与正常组相比，模型组、空白组、上调组OSX、OSN、OPN水平明显降低(P<0.05)；与模型组相比，空白组、上调组OSX、OSN、OPN水平明显升高(P<0.05)；与空白组相比，上调组OSX、OSN、OPN水平明显升高(P<0.05)。

2.4成骨细胞分化能力观察 如图2所示，成骨诱导液诱导7 d后进行碱性磷酸酶染色，14 d后进行茜素红染色结果显示：成骨细胞矿化诱导后产生大量的矿化结节，碱性磷酸酶染色显示成骨细胞分化能力增强。

表1 miR-19b在各组中的表达水平及其对成骨细胞相关蛋白和Rho/ROCK信号通路的影响

2.5miR-19b对成骨细胞RhoA/ROCK信号通路的影响 如表1、图3所示，与正常组相比，模型组、空白组、上调组RhoA、ROCK水平明显升高(P<0.05)；与模型组相比，空白组、上调组RhoA、ROCK水平明显降低(P<0.05)；与空白组相比，上调组RhoA、ROCK水平明显降低(P<0.05)。

图2 成骨细胞分化(×200)

图3 Western印迹检测各组RhoA、ROCK蛋白表达

3 讨 论

骨质疏松是由于骨代谢中的骨吸收和骨生成失衡所导致的一种疾病，可导致患者骨量减少、骨密度降低，进而引起一系列的临床症状，该病是一种增龄性病变，随着我国人口老龄化的加速，骨质疏松的发病率逐年上升〔6，7〕。有研究指出〔8〕，随着骨质疏松患者骨量的减少，骨微结构的改变，会导致患者出现腰酸背痛、四肢疼痛、脊柱畸形、骨折的问题，其中骨折是导致患者发生全身性骨病的主要原因，严重影响患者的生活质量。成熟的成骨细胞存在于骨膜内层和骨膜小梁表面，成骨细胞和成骨细胞的定向分化促进成骨细胞的形成，正常的骨量可维持成骨细胞骨的形成和破骨细胞的骨吸收〔9〕，在成骨过程中，基质分泌的胶原蛋白可为矿物质沉积提供纤维框架，使类骨质矿化成正常骨组织。MSCs是成骨细胞的原始细胞，在骨质疏松症患者骨代谢失衡过程中起骨修复作用，近年来发现，随着年龄的增长，MSCs也会逐渐呈老化状态，再加上骨代谢的严重失衡，会进一步形成骨质疏松〔10〕。MSCs化为成骨细胞是一个极为复杂的过程，该过程必须在多种信号通路的作用下才能进行，且骨钙素和碱性磷酸酶是MSCs成骨分化的重要表现〔11，12〕。研究指出〔13〕，MSCs具有一定的多向分化的能力，在相关条件的诱导下，其可定向分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞。

miRNA转录后可通过抑制靶基因的表达控制疾病的进一步发展，其差异表达可能在骨质疏松中发挥重要作用〔14，15〕。已有研究证实〔16〕，miRNA与骨的胚胎发育，调节干细胞成骨作用和软骨细胞代谢中具有重要作用。miR-19b是否直接参与了成骨的调控，目前尚不明确，但当miR-19b表达量上升时可有效抑制胶原蛋白的合成，促进骨质矿化，有利于骨质生成。本文研究中，上调miR-19b表达量可促进MSCs成骨分化〔17，18〕。有研究指出〔19〕，miR-19b在骨质疏松患者体内其表达量显著下降，且在骨质疏松伴随骨折患者的外周血中下降的尤为明显，提示miR-19b与骨量丢失呈负相关，miR-19b表达量越高，成骨细胞分化能力越强，为临床上治疗骨质疏松提供新的方向。OSX能反映成骨细胞分化程度，其只在骨组织细胞中表达，与骨质疏松的发生与发展密切相关。研究指出〔20〕，OSN可与Ⅰ型胶原相结合形成非可溶性复合物，进而促进钙、磷持续性沉淀，最后形成羟基磷灰石结晶，羟基磷灰石结晶上的阴离子末端可通过与骨黏连蛋白相结合，然后形成羟基磷灰石-OSN-Ⅰ型胶原复合物，这一过程可有效促进骨的生成和骨的重建，促进骨质疏松患者身体的恢复。OPN是一种重要的细胞黏附因子和趋化因子，能促进骨基质的矿化，维持骨的完整性，参与骨重塑过程，具有细胞黏附蛋白和细胞因子的双重作用，可参与成骨细胞表面各种酶的活化，在MSCs成骨分化中发挥重要作用。本研究提示，上调miR-19b可提高OSX、OSN、OPN蛋白水平，改善骨质疏松大鼠MSCs成骨分化。

RhoA/ROCK信号通路在调控成骨细胞活性中起着重要作用，RhoA是Ras超家族成员之一，其可以通过下游的效应因子促进细胞肌动蛋白骨架的重建，ROCK是目前研究较为深入的一种Rho下游底物〔21〕，而Rho在成骨细胞分化，各种生理、病理过程中均发挥重要作用，其可将细胞外的基质信号，传递到细胞骨架之中，继而改变成骨细胞的形态。研究指出〔22〕，RhoA/ROCK信号通路在参与细胞骨架形成的过程中，可通过改变细胞之间不同的接触面积来促进成骨分化。本研究提示，上调miR-19b可通过调控RhoA/ROCK通路蛋白来改善骨质疏松大鼠MSCs成骨分化。