丁基苯酞对脑出血模型大鼠海马区细胞凋亡的影响及相关机制

谭明万 黄艳 胡亮 黄方舟

(长沙市第四医院急诊急救中心，湖南 长沙 410013)

脑出血是一种非外伤性脑组织内血管破裂而引起的神经内科疾病，其病理发生机制主要为出血后血肿、局部脑血流改变、周边水肿带的形成、炎症因子及脑组织血管活性物质过度释放等，导致脑内神经细胞的自由基受损和过度凋亡等问题，引起神经功能受损〔1,2〕。丁基苯酞是在芹菜籽中提取的化学成分之一，相关研究发现，其具有增加缺血区脑灌注〔3〕、清除自由基、抑制神经细胞凋亡〔4〕、减轻脑水肿〔5〕、减少氧化反应及炎症反应〔6〕等作用。因丁基苯酞治疗脑出血的研究减少，鉴于此，本文研究丁基苯酞对脑出血模型大鼠海马区细胞凋亡的影响及相关机制，为临床治疗脑出血提供有效数据参考。

1 材料与方法

1.1研究动物 选取50只健康雄性SD大鼠，6～10月龄，体重330～480 g，购自北京科奥力饲料有限公司，合格证号为京动(2000)第015号。50只大鼠分笼饲养，按时更换垫料并给予饲料、饮水，温度保持21～25℃，湿度保持在40%～50%。

1.2方法

1.2.1脑出血模型大鼠的建立 从50只大鼠中任意选取10只大鼠为正常组，其余40只大鼠参考郑希院等〔7〕文献中脑出血模型建立，使用400 mg/kg 10%的水合氯醛麻醉注射于大鼠腹部，将大鼠于立体仪上固定，剃除大鼠头部体毛并于头部正中做纵行切口，将骨膜剥离，充分显露冠状缝和前囟，钻直径>1.0 mm小孔于前囟前中线右侧2 mm、中线右侧3 mm处，抽取股动脉50 μl血液在钻孔处垂直进针5 mm左右，注入抽取的股动脉血，留针10 min后退出，使用消毒针缝合切口。大鼠脑横断面可见明显血肿，血液没有出现针道反流的情况，蛛网膜下腔无出血为建模成功，成功36只。

1.2.2分组和用药 于建模成功6 h后将36只大鼠随机分为模型组、低剂量组、中剂量组和高剂量组，各9只。低、中、高剂量组分别给予10、20、30 mg/kg的丁基苯酞，将其溶于大豆油中，每天进行2次灌胃。正常组和模型组(9只)给予等体积的大豆油代替灌胃。

1.2.3大鼠脑组织苏木素-伊红(HE)染色观察 于最后一次给药后5 h进行麻醉，断头处死取其脑组织置于4℃冰箱中固定2 d；取出固定的组织，使用手术刀将其切成2 μm厚的样品；将样品经乙醇梯度脱蜡至水，随后放入Harris苏木素染4～10 min，用纯净水清洗；迅速用1%的盐酸乙醇进行分色，置于纯净水10～20 min；放入伊红染液中染色3 min；常规脱水后封片，于显微镜下进行观察。

1.2.4大鼠海马区细胞凋亡率的检测 采用流式细胞仪(北京德利卡生物科技有限公司)检测大鼠海马区细胞凋亡率，在37℃、5% CO2环境中培养，待细胞传代至5孔板，将0.25%胰蛋白酶加入进行消化，1 500 r/min的离心机处理10 min海马区细胞，磷酸盐缓冲液(PBS)清洗2次，于避光常温处将离心的海马区细胞收取，加入5 mg/L Hoechst33258染色10 min，60 min后用特异荧光标记，用鞘液包裹，严格按照流式细胞仪操作说明进行检测。

1.2.5脑组织含水量、学习记忆能力评分、Bederson神经功能评分的测定 (1)使用干湿质量法检测脑组织含水量：分别测量(精度0.1 mg的电子天平)各组大鼠脑组织湿重，随后放置于100℃的恒温干燥箱进行1 d的烘焙，脑组织不再减轻后暂停，测量大鼠脑组织质量。(脑组织湿质量-脑组织干质量)/脑组织湿重×100%=脑组织含水量。(2)参考彭璇等〔8〕文献中介绍的方法，采用Morris水迷宫实验装置，记录大鼠学习记忆能力评分。大鼠在Morris水迷宫中的训练6 d后，于第7天将时间均值记录下来，为最终测定效果。(3)采用Longa评分方法评定大鼠神经功能，无任何体征为0分；大鼠前肢不能全部伸直为1分；大鼠一侧肢体瘫痪且有追尾现象为2分；大鼠不能站立、不能打滚为3分；有意识障碍且无自发性活动为4分。

1.2.6大鼠海马区细胞凋亡相关蛋白的检测 应用Western印迹法测定高迁移率族蛋白(HMGB)1、血管内皮生长因子(VEGF)、半胱天冬酶(Caspase)3、B细胞淋巴瘤-2基因(Bcl-2)、Bcl-2相关的X基因(Bax)表达。RIPA缓冲液提取总细胞裂解物，配置12%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE,恒压80 V,2 h)，将蛋白质分离后转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜，密封于5%脱脂奶粉中,并在4℃下与一抗孵育过夜。用缓冲液洗膜，作用15 min，重复3次。孵育膜与二抗，于5℃中作用120 min，然后涂上发光剂，曝光并扫描。采用Image J 软件进行灰度分析，参照蛋白为β-actin。

1.3统计学处理 采用SPSS26.0软件进行方差齐性比较、独立样本t检验。

2 结 果

2.1大鼠脑组织HE观察 如图1所示，正常组神经细胞、胶质细胞均正常；模型组脑出血组织细胞间隙增加、神经细胞固缩及胶质细胞数目增加、体积扩大；低、中、高剂量组脑组织的胶质细胞和神经细胞体积增大，炎性细胞浸润、细胞体积增大等情况有所缓解；高剂量组较低、中剂量组脑组织排列规范，胶质细胞和神经细胞体积增大等情况明显减退。

2.2大鼠海马区细胞凋亡情况 正常组细胞低强度荧光呈现均匀，细胞核椭圆形或圆形，边缘清晰；模型组凋亡细胞显著增多，表现为亮蓝色荧光核浓染致密，呈固缩形态，部分出现颗粒荧光、核小体破裂；流式细胞仪检测结果表明，经丁基苯酞干预后凋亡细胞减少，且随着丁基苯酞的剂量增大，其抑制细胞凋亡的效果增强。见图2。

图1 各组脑组织(HE染色，×400)

图2 各组海马区细胞凋亡(TUNEL染色，×400)

2.3各组脑组织HMGB1、VEGF蛋白表达的比较 如图3、表1所示，与正常组相比，模型组、低、中、高剂量组脑组织HMGB1蛋白表达升高，VEGF蛋白表达显著降低(P<0.05)；与模型组相比，低、中、高剂量组脑组织HMGB1蛋白表达显著降低，VEGF蛋白表达显著升高(P<0.05)；与低剂量组相比，中、高剂量组脑组织HMGB1蛋白表达显著降低，VEGF蛋白表达显著升高(P<0.05)；与中剂量组相比，高剂量组脑组织HMGB1蛋白表达降低，VEGF蛋白表达升高，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.4各组脑组织含水量、学习记忆能力评分、Bederson神经功能评分的比较 如表1所示，与正常组相比，模型组、低、中、高剂量组脑组织含水量、学习记忆能力评分、Bederson神经功能评分均显著升高(P<0.05)；与模型组相比，低、中、高剂量组脑组织含水量、学习记忆能力评分、Bederson神经功能评分均显著降低(P<0.05)；与低剂量组相比，中、高剂量组脑组织含水量、学习记忆能力评分、Bederson神经功能评分均显著降低(P<0.05)；与中剂量组相比，高剂量组脑组织含水量、学习记忆能力评分、Bederson神经功能评分均显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。

1～5:模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组、正常组；图4同图3 各组HMGB1、VEGF蛋白表达

表1 各组脑组织含水量、学习记忆能力评分、Bederson神经功能评分、HMGB1及VEGF蛋白表达比较

2.5各组海马区细胞凋亡相关蛋白的比较 如表2、图4所示，与正常组相比，模型组、低、中、高剂量组海马区Caspase3、Bcl-2蛋白表达均显著降低，Bax蛋白表达显著升高(P<0.05)；与模型组相比，低、中、高剂量组海马区Caspase3、Bcl-2蛋白表达均显著升高，Bax蛋白表达显著降低(P<0.05)；与低剂量组相比，中、高剂量组海马区Caspase3、Bcl-2蛋白表达均显著升高，Bax蛋白表达显著降低(P<0.05)；与中剂量组相比，高剂量组海马区Caspase3、Bcl-2蛋白表达均升高，Bax蛋白表达降低，差异有统计学意义(P<0.05)。

表2 各组海马区细胞凋亡相关蛋白的比较

图4 各组Caspase3、Bcl-2、Bax蛋白表达

3 讨 论

脑出血是一种临床比较常见的神经内科疾病，在全部脑卒中患者中，脑出血患者占20%～30%〔9〕。有报道称，脑出血发生的主要原因与糖尿病、高脂血症、高血压、血管老化等密切相关〔10〕。据相关报道〔11〕，中老年人群和高血压患者发生脑出血概率较高，且随着我国日常生活质量及人口老龄化现象的不断升高，脑出血发病率、病死率、致残率呈上升趋势。脑出血病情严重、进展快，常因情绪激动、费力用尽时突然发病，其发病后主要临床表现为头晕、头痛及认知、运动、言语障碍等〔12〕。脑出血早期死亡率较高，幸存者中大多数患者均留有一系列后遗症，严重影响身心健康及生活质量〔13〕。

丁基苯酞具有多种药理作用，其可通过降低花生四烯酸含量，升高脑血管内皮一氧化氮(NO)和前列环素(PGI2)的水平，使细胞内钙浓度降低，抑制氧自由基，减少谷氨酸释放和改善抗氧化活性等机制达到抗脑缺血、减轻脑水肿、抗脑血栓形成和抗血小板聚集等作用〔14,15〕。动物学研究表明〔16〕，采用Longa改良缝线闭塞法建立永久性大脑中动脉鼻塞模型小鼠，观察到丁基苯酞可升高VEGF表达，使血脑屏障通透性降低，改善脑梗死小鼠神经功能缺损及脑水肿。在本文研究中，丁基苯酞可降低脑出血模型大鼠脑组织含水量、学习记忆能力评分、Bederson神经功能评分，改善大鼠记忆功能及神经功能，减少脑含水量。

HMGB1是目前为止仅有的能够在细胞外诱导细胞因子活化及分泌炎症细胞的核内蛋白，在修复组织损伤等多种生理病理过程中具有重要作用。研究表明〔17〕，肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1、γ-干扰素(IFN-γ)等炎性细胞因子可刺激下单核-巨噬细胞释放HMGB1，HMGB1也可刺激下单核-巨噬细胞分泌TNF-α、IL-10、IL-6等炎症介质，参与调解远期的诱导炎症反应及免疫细胞应答近期的损伤，加重局部水肿和渗出。VEGF是一种促血管生长因子，其通过与VEGF受体(VEGFR)-1、VEGFR-2等结合激活络氨酸激酶，增加血管内皮细胞通透性，介导内皮细胞分化、增殖、形成临时基质等一系列生物效应，达到促进血管生成的作用〔18〕。涂鄂文等〔19〕研究结果中，脑出血大鼠经丁基苯酞干预后VEGF、血管生成素(Ang)-2蛋白表达上调，且丁基苯酞并未增加大鼠颅内出血的风险。本文研究结果显示，丁基苯酞可升高脑出血模型大鼠脑组织VEGF蛋白表达，降低HMGB1蛋白表达，减轻神经功能缺损，增加大鼠出血周围新生血管密度。

在临床检测细胞凋亡情况的蛋白中，Caspase3、Bcl-2、Bax较为常见，检测Caspase3、Bcl-2、Bax表达能够比较准确地评价细胞的凋亡情况〔20〕。在Caspase家族中，Caspase3是诱发细胞凋亡的关键。Bcl-2、Bax属于线粒体凋亡通路上的重要组成蛋白，吴晓光等〔21〕指出，干预脑出血大鼠可通过调控Bcl-2、Bax表达，达到抑制脑组织神经死亡、起到脑保护的作用。本研究发现，丁基苯酞可升高脑出血模型大鼠海马区Caspase3、Bcl-2蛋白表达，降低Bax蛋白表达，提示丁基苯酞可能通过调控Caspase3、Bcl-2、Bax的表达达到抑制大鼠海马区神经细胞凋亡的作用。

综上所述，丁基苯酞改善脑出血模型大鼠记忆功能及神经功能，减少脑含水量，减轻神经功能缺损，增加大鼠血肿部位新生血管密度，通过调控Caspase3、Bcl-2、Bax的表达达到抑制大鼠海马区神经细胞凋亡的作用。