亚低温对SAH大鼠ROS表达水平及神经元细胞的影响

姚书眈 王力航 汤倩 陈啟鸰 蒲兴魏 陆廷盛 罗春山

(1贵州省骨科医院脊柱外科，贵州 贵阳 550004；2贵州医科大学附属医院烧伤整形科)

蛛网膜下腔出血(SAH)预后较差〔1〕。根据病理生理特征，该病的病程可分为两个阶段：早期脑损伤和晚发性脑血管痉挛〔2〕。研究表明，在SAH急性期，诸如颅内压升高和总脑血流量减少等病理变化是SAH预后不良的重要原因〔3〕。研究病因并探索减缓SAH急性期进程的有效措施对其治疗至关重要〔4〕。线粒体的氧化应激和异常的能量代谢是急性期SAH的重要原因之一。SAH急性期的脑缺血和缺氧会释放大量线粒体活性氧(ROS)，并容易对神经组织造成氧化损伤〔5,6〕。此外，过量ROS还可通过活化Toll样受体(TLR)、降钙素基因相关肽(CGRP)等信号通路,导致线粒体细胞凋亡,抑制线粒体生物合成,损伤线粒体能量代谢,诱导炎症反应和细胞凋亡〔7〕。已有诸多研究报道显示，亚低温能够显著改善脑部疾病患者的组织损伤程度〔8〕。研究表明，在SAH急性期进行亚低温干预对脑血管痉挛的延迟没有缓解作用，但可以改善脑组织的缺氧耐受性，从而减少SAH的晚期脑损伤〔9〕。最近的研究表明，在SAH急性期诱导线粒体自噬可以通过消除受损的线粒体来减少神经元凋亡。这表明线粒体功能是SAH急性期大脑保护的重要目标。但是，轻度低温干预SAH线粒体功能的机制仍不清楚〔10〕。本研究旨在探究亚低温对自发性SAH大鼠线粒体ROS功能及脑组织液的影响。

1 材料与方法

1.1实验动物 体重为150～186 g的3～4周龄健康雄性SD大鼠，由贵州医科大学实验动物中心提供。

1.2仪器与试剂 氯醛(苏州甫路生物科技有限公司)，石蜡(盛威石化有限公司)，酒精(八方化工有限公司)，乙醇(兴旺化工有限公司)，苏木素(甘肃益生祥生物公司)，伊红(武汉华翔科洁生物公司)，二甲苯(济南文泰化工有限公司)，谷氨酸(深圳乐芙生物科技公司)，苹果酸(江苏采薇生物科技公司)，二氯荧光素(美国Sigma公司)，蛋白酶K(广州美基生物科技公司)，磷酸盐缓冲液(PBS，武汉海山科技有限公司)，树胶(沧州蜂源蜡业有限公司)，兔抗鼠CGRP(英国Abcam公司)，逆转录试剂盒(美国Ferment公司)。实验中所用引物由上海生工生物工程公司合成。MC-108型电子体温计(美国Thermo Fisher公司)，恒温加热毯(河北方向电器有限公司)，SteponePlus型荧光定量PCR仪(美国ABI公司)。

1.3动物模型的制备及分组 将所选取的大鼠随机分组，常温(NT)组：制作SAH大鼠模型并处于常温环境下生长；对照(CO)组：制作假手术模型，注射等量生理盐水，处于常温环境下生长；亚低温(MH)组：制作SAH大鼠模型并处于亚低温环境下生长，每组6只。

采用100 g/L水合氯醛腹腔注射麻醉(3 ml/kg)，将 MC-108型电子体温计探头插入大鼠直肠4～5 cm监测肛温，用恒温加热毯将肛温维持于(37.0±0.5)℃。常规切开大鼠头顶部皮肤，于前囟前中缝7.5 mm处钻1孔，于冠状缝后4.6 mm、中线两侧5 mm处各钻1孔。30 min后，用1 ml注射器抽取大鼠自体股动脉血0.6 ml。将注射器针头斜向后30°，刺入前囟前孔，针头至视交叉前池前3 mm处颅底，于5 min内注入动脉血。脑池注血后脑血流量降低至20%～40%定义为SAH模型制备成功。NT组和CO组大鼠维持脑温度36.5～37.5℃，MH组大鼠用冰袋覆盖大鼠体表进行降温，维持脑温度32.5～33.5℃，所有大鼠生存环境相同，常规处死大鼠用于后续试验。

1.4脑组织超微结构观察 左脑海马CA1区固定于4%多聚甲醛24 h以上，将脱水盒放进吊篮里于脱水机内依次梯度酒精进行脱水。取左脑海马CA1区1 mm3经石蜡包埋，切片后，将其置于烘箱烤2 h。于二甲苯中浸泡脱蜡2遍，每次15 min；梯度浓度酒精脱水；蒸馈水2 min。苏木素染色液染色3 min。自来水冲洗5 min，蒸馏水浸泡10 min，95%乙醇5 s。伊红染色液染色30 s。在显微镜下观察染色情况，中性树胶封片。置于通风处干燥后，在显微镜下观察。

1.5线粒体ROS产生速率测定 采用二氯荧光素法检测线粒体ROS生成速率，取5 mg线粒体加入测定介质中，再加入谷氨酸、苹果酸，浓度分别为10、5 mmol/L，启动线粒体呼吸，继而加入5 mmoL/L二氯荧光素，37℃避光水浴15 min，发射波长521 nm连续测定2 min，计算线粒体ROS产生速率。

1.6TUNEL法检测神经元细胞凋亡 石蜡切片置于切片架上烘箱烘烤2 h，脱蜡脱水。滴加20 g/ml不含DNase的蛋白酶K。37℃作用20 min，用PBS洗涤3次。3% H2O2的溶液中室温作用10 min，PBS洗涤。加生物素标记液50 μl，37℃，孵育60 min，用PBS清洗。加0.1 ml反应终止液终止，室温作用10 min。在样品上加50 μl Streptavidin-HRP工作液，室温孵育30 min。PBS洗涤3次。滴加0.2 ml二氨基联苯胺(DAB)混合液，在显微镜下观察作用时间。苏木素复染，梯度浓度酒精脱水；二甲苯透明2遍，每次15 min。中性树胶封片，于荧光显微镜下观察染色结果并拍照。

1.7RT-PCR法检测大鼠脑组织中CGRP mRNA的表达 把保存在-80℃环境中脑组织取出，研磨，提取总RNA，将逆转后所得的cDNA进行荧光反应实验。所有反应严格按照反应的条件进行扩增，内参采用GAPDH，CGRP引物序列上游引物：5′-CCTGGTTGTCAGCATCTTG-3′，下游：5′-AGCCTCCTGTTCCTCCTC-3′。GAPDH上游引物：5′-TGAACGGGAAGCTCACTGG-3′，下游：5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′。变性3 min 95℃，变性5 s 95℃，退火1 min 60℃，共进行40次。取得到的平均值后得到Ct值，采用2-△△Ct法进行计算并分析。

1.8Western印迹检测大鼠脑组织中CGRP蛋白含量 洗净烘干电泳槽及其他部件。将电泳装置放置聚胶1 h，配制灌注成层胶。0.25%胰酶消化细胞，离心弃上清，加入细胞裂解液，在低温高速30 min，吸取蛋白上清液。随后95℃热浴10 min，对蛋白进行变性。分别加入样品悬液50 μg/孔。90 V电泳，电泳终止，取出凝胶，甲醇放入聚偏氟乙烯(PVDF)膜放置5～10 s，加进转膜液，转膜槽进行冰浴，70 V，1.5 h。转膜完成，用TBST洗2次，10 min/次。水平摇床密封2 h。然后把PVDF膜装进有一抗(兔抗鼠CGRP，1∶1 500，英国Abcam公司)的自制杂交袋内，4℃过夜。待膜取出，洗3次，10 min/次，冲洗完成后，把膜放入对应的二抗(辣根过氧化酶标记荧光抗体，1∶2 000)中常温孵育1.5 h。洗3次，10 min/次，将ECL显色液A液和B液混合为工作液，按1:1比例，加工作液至PVDF膜内。大概1 min。PVDF膜检测采用自动化学发光成像分析。

1.9统计学分析 采用SPSS22.0软件进行方差分析。

2 结 果

2.1各组脑组织超微结构比较 透射电镜观察显示，CO组CA1区脑组织结构正常，核周边内质网、线粒体等细胞器丰富；NT组CA1区部分脑组织损伤明显，细胞器溶解；MH组CA1区脑组织结构基本正常，细胞膜和细胞核结构无明显损伤，见图1。

2.2各组线粒体ROS产生速率比较 NT组ROS产生速率〔(17.45±3.12)%〕显著高于MH组〔(13.17±2.58)%〕；MH组ROS产生速率明显高于CO组〔(6.43±1.48)%，P<0.05〕。

2.3各组神经元细胞凋亡情况比较 NT组神经元细胞凋亡率(23.65%)显著高于MH组(13.64%，P<0.05)，MH组神经元细胞凋亡率明显高于CO组(8.47%，P<0.05)。

2.4各组脑组织中CGRP mRNA表达比较 NT组脑组织的CGRP mRNA表达(0.34±0.12)显著低于MH组(0.59±0.21，P<0.05)，MH组脑组织的CGRP mRNA表达量明显低于CO组(0.82±0.26，P<0.05)。

2.5各组脑组织中CGRP蛋白含量比较 NT组脑组织的CGRP 蛋白含量(0.46±0.12)显著低于MH组(0.74±0.36，P<0.05)，MH组蛋白含量明显低于CO组(1.03±0.56，P<0.05)。见图2。

图1 3组脑组织超微结构

图2 Western印迹检测脑组织中CGRP蛋白表达

3 讨 论

SAH指脑底部或脑表面的病变血管破裂，血液直接流入蛛网膜下腔引起的一种临床综合征，又称为原发性SAH，约占急性脑卒中的10%，是较为严重的常见疾病〔11〕。导致SAH的常见病因有颅内动脉瘤、动静脉畸形等，该病在任何年龄均可发病，其中，多见于青年人。SAH发病急促，一旦出现异常症状应及时救治，以免相关并发症的发生，对患者造成二次伤害〔12〕。

相关报道显示，亚低温在SAH大鼠发作期间能够保护大脑，脑组织结构基本恢复，线粒体结构清晰，脑血流量监测结果显示，亚低温对脑池注血后脑血流量下降程度及恢复速度无明显影响，提示亚低温对SAH急性期的保护效应可能是通过影响神经元内在因素而实现的〔13〕。研究结果表明，亚低温降低了ROS在线粒体呼吸中所占比例，增加了呼吸链氧化磷酸化耦联程度。脑缺血抑制线粒体呼吸链复合体活性是线粒体ROS产生增多和脑组织出现障碍的主要原因〔14〕。研究显示，亚低温可改善缺血心肌线粒体呼吸链复合体活性，同时，亚低温可抑制SAH急性期线粒体氧化应激，并促进线粒体能量代谢恢复，防止脑组织进一步受到伤害〔15〕。报道表明，患SAH大鼠体内神经元细胞的凋亡速率与正常健康大鼠相比较有显著差异，其机制可能为由于疾病导致大鼠脑组织受损，进而加快细胞的凋亡〔16〕。动物实验研究发现，在发生SAH后的短时间内，为维持脑内血流量，神经末梢内的CGRP大量释放入血液中，其水平明显升高。随时间推移神经末梢中CGRP逐渐耗竭，血液中CGRP水平也逐渐下降，表明SAH的发生可导致CGRP水平大幅波动〔17,18〕。研究发现，亚低温干预抑制了SAH对脑组织CGRP表达的下调效应，继而推测，亚低温可能通过上调CGRP表达来实现SAH急性期脑组织线粒体保护效应，改善SAH急性期线粒体呼吸链工作效率，在提高线粒体能量输出水平的同时也抑制了ROS的产生〔19～21〕。本研究结果与上述结论相近。

综上，亚低温可能通过上调CGRP的表达来降低SAH大鼠体内线粒体ROS的活性，从而抑制神经元凋亡。