基于PI3K/PTEN/Akt信号通路探讨Hp阳性萎缩性胃炎的作用机制

周海娟 陈刚 李枝锦 黄少君 王松海

(海口市中医医院，海南 海口 570216)

慢性萎缩性胃炎(CAG)是一种临床比较多见的一种慢性胃部疾病，胃黏膜的慢性炎症和固有腺体萎缩是其主要的病理特征〔1〕。CAG 的发生与幽门螺旋杆菌(Hp)感染密切相关，流行病学调查结果显示，慢性胃炎中60%～80% 患者均显示为Hp 阳性〔2〕。由于Hp 具有黏附性、运动性强等特点，极易产生抗生素耐药，在治疗上具有一定的难度，所以寻找新的作用靶点对于临床防治CAG意义重大。第 10 号染色体缺失的磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)及磷脂酰肌醇 3-激酶(PI3K)/ 蛋白激酶 B(Akt) 信号通路在调控细胞增殖、生长代谢等方面具有重要作用〔3,4〕。研究报道Hp 可能诱导PTEN高表达，并通过PI3K/Akt信号途径抑制 Akt 磷酸化，促进胃黏膜细胞的凋亡〔5〕。本研究以PTEN/PI3K/Akt信号通路为作用靶点，探讨其在Hp阳性CAG中的发病机制。

1 材料与方法

1.1动物 70只8周龄SPF级Wistar 大鼠，雌雄各半，体质量180～200 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号：SCXK (湘) 2017-0003。

1.2试剂 胃蛋白酶测试盒、大鼠胃泌素(GAS)、胃蛋白酶原(PG)Ⅰ、PGⅡ试剂盒，均购自南京建成生物工程研究所；PI3K、Akt小分子RNA、PTEN慢病毒载体购自上海吉凯基因化学技术有限公司；羊抗大鼠PI3K、PTEN、Akt、B细胞淋巴瘤2蛋白(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-9、β-actin抗体购自美国 Santa Cruz 公司。

1.3仪器 低温高速离心机〔赛默飞世尔科技(中国)有限公司〕；X73型倒置荧光显微镜(日本OLYMOUS公司)；超声匀浆器(日本SANYO公司)；凝胶成像系统(美国BIO-RAD公司)。

1.4大鼠Hp阳性萎缩性模型制备 取50只大鼠，灌胃抗生素溶液2 ml，连续3 d，1次/d，清除胃内杂菌；第4天灌胃吲哚美辛1 ml，共2 d，1次/d，破坏胃黏膜屏障；第6天灌胃 50 g/L碳酸氢钠溶液2 ml，15 min后灌胃Hp菌悬液(菌量为1×1012CFU/L)1 ml，隔日1次，共6次；间隔28 d后灌胃水杨酸钠和乙醇混合溶液 2 ml，连续8 w，1次/d；灌胃前禁食12 h、灌胃4 h后进食。

1.5实验分组 取10只健康大鼠作为对照1组，另外取10只Hp阳性CAG模型大鼠，检测胃蛋白酶活性、胃液分泌量；血清GAS、PGⅠ、PGⅡ水平； 取胃黏膜组织检测PI3K、PTEN、Akt蛋白表达。取10只健康大鼠作为对照2组，另外取40只Hp阳性CAG模型大鼠，随机分为阴性对照(NC)组，PI3K基因沉默(sh-PI3K)组，Akt基因沉默(sh-Akt)组、PTEN过表达(miR-PTEN)组，每组10只。NC、miR-PTEN通过尾静脉分别注射空白载体及PTEN慢病毒载体，sh-PI3K、sh-Akt组通过尾静脉注射PI3K-shRNA、Akt-shRNA，连续 2 次，每月 1 次。检测胃蛋白酶活性、胃液分泌量；血清GAS、PGⅠ、PGⅡ水平；Hp 检测胃组织 Hp 阳性率；取胃黏膜组织检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-9 表达。

1.6检测指标

1.6.1测定胃蛋白酶活性及胃液分泌量 实验结束后，10% 水合氯醛腹腔注射，大鼠麻醉后仰位固定，垫高头部，暴露胃部，在幽门下方 0.3 cm 处结扎，5 h 后剪开结扎处，收集胃液，4 000 r/min离心15 min，测量上清液体积，取2 ml上清液，13 000 r/min离心10 min，取上清液，测定胃蛋白酶活性。

1.6.2检测血清中 PGⅠ、PGⅡ、GAS水平 大鼠麻醉后腹主动脉采血，3 500 r/min离心 15 min，取血清，酶联免疫吸附试验(ELISA)检测PGⅠ、PGⅡ及GAS水平，计算PGⅠ/PGⅡ比值。测定时严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.6.3检测Hp 阳性情况 大鼠麻醉后剖腹，摘出全胃，沿胃大弯剪开，取前后胃窦部及部分胃体胃壁3 mm×10 mm，10%多聚甲醛固定，石蜡包埋，5 μm切片，HE染色，光镜下观察Hp 阳性情况。

1.6.4Western印迹检测胃组织PI3K、PTEN、Akt、Bcl-2、Bax、Caspase-9蛋白表达 取大鼠胃组织，加入放射免疫沉淀(RIPA)裂解液充分匀浆，离心15 min(4℃、12 000 r/min)，BCA蛋白定量法测定上清液蛋白浓度，加上样缓冲液和样品，上样量100 μg蛋白，经电泳、转膜、脱脂、封闭后，加入一抗PI3K、PTEN、Akt、Bcl-2、Bax、Caspase-9、β-actin，4℃ 孵育过夜，TBST洗涤，加入二抗，室温孵育 2 h，TBST 洗涤， 电化学发光(ECL)显影并扫描，化学发光仪成像。

1.7统计学方法 采用SPSS17.0软件进行t检验、χ2检验。

2 结 果

2.1胃液分泌量及胃蛋白酶活性 与对照1组相比，模型组胃蛋白酶活性明显降低，胃液分泌量明显减少(P<0.05)，见表1。

2.2血清PGⅠ、PGⅡ及GAS水平 与对照1组相比，模型组血清PGⅠ/PGⅡ比值、GAS含量明显降低(P<0.05)，见表1。

2.3PI3K、Akt、PTEN蛋白表达 与对照1组相比，模型组胃组织PI3K、Akt 蛋白表达明显升高，PTEN蛋白表达明显降低(P<0.05)，见表1、图1。

表1 两组胃蛋白酶活性及胃液分泌量、血清PGⅠ/PGⅡ、GAS水平、胃组织PI3K、Akt、PTEN蛋白表达

图1 Hp阳性CAG大鼠胃组织PI3K、Akt、PTEN蛋白表达

2.4调节PI3K、Akt、PTEN表达后胃蛋白酶活性及胃液分泌量 与对照2组比较，NC组胃蛋白酶活性明显降低，胃液分泌量明显减少(P<0.05)；与NC组比较，sh-PI3K、sh-Akt、miR-PTEN组胃蛋白酶活性明显升高，胃液分泌量明显增加(P<0.05)，见表2。

2.5调节PI3K、Akt、PTEN表达后血清PGⅠ/PGⅡ、GAS水平 与对照2组比较，NC组血清PGⅠ/PGⅡ、GAS含量显著降低(P<0.05)；与NC组比较，sh-PI3K、sh-Akt、miR-PTEN组血清PGⅠ/PGⅡ、GAS含量显著升高(P<0.05)，见表2。

2.6调节PI3K、Akt、PTEN表达后胃组织 Hp 阳性情况 与对照2组比较，NC组胃组织 Hp 阳性率明显升高(P<0.05)；与NC组比较，sh-PI3K、sh-Akt、miR-PTEN组胃组织 Hp 阳性率明显降低(P<0.05)，见表2。

2.7调节PI3K、Akt、PTEN表达后胃黏膜组织Bcl-2、Bax、Caspase-9 蛋白表达 与对照2组比较，NC组胃组织Bcl-2、Bax、Caspase-9表达明显升高(P<0.05)；与NC组比较，sh-PI3K、sh-Akt、miR-PTEN组胃组织Bcl-2、Bax、Caspase-9表达明显降低(P<0.05)，见表2、图2。

表2 各组胃蛋白酶活性及胃液分泌量、PGⅠ/PGⅡ、GAS水平、胃组织Hp阳性率、胃黏膜组织Bcl-2、Bax、Caspase-9 蛋白表达

1～4：对照2组、NC组、sh-PI3K组、sh-Akt组、miR-PTEN组图2 调节PI3K、Akt、PTEN表达后胃黏膜组织Bcl-2、Bax、Caspase-9 蛋白表达

3 讨 论

PI3K/Akt 信号通路由 PI3K、Akt 及下游相关分子组成，PI3K 通过调控磷脂酰肌醇三磷酸(PIP3)参与细胞内的信号转导，具有抑制细胞凋亡的作用〔6,7〕，而PIP3 又会导致 PI3K/Akt 信号通路的失衡，进而介导 NF-κB 等炎症因子的释放、抑制细胞的凋亡〔8,9〕。PTEN 可以调控多种细胞信号转导通路，具有促进细胞凋亡、降低细胞存活率、调控细胞周期等作用〔10〕。PTEN 作为PI3K/Akt 信号通路的重要负性调控因子，可以拮抗 PI3K的作用，它通过下调 PIP3 水平，使得PI3K功能丧失，从而对 PI3K/Akt 通路介导的细胞凋亡起调控作用〔11,12〕。诸多研究报道，在 Hp 所致的胃黏膜损伤过程中，增殖和凋亡的紊乱是关键原因〔5〕。Hp 可能诱导 PTEN高表达，并通过PI3K/Akt 信号途径促进胃黏膜细胞的凋亡〔13〕，Dunn 等〔14〕研究发现，Hp培养上清液可以抑制胃黏膜上皮细胞的增殖，并促进细胞凋亡，其机制可能是诱导PTEN 高表达，并通过 PI3K/Akt 信号途径抑制 Akt 磷酸化。Tsugawa 等〔15〕研究显示，PTEN 过表达后，可抑制 PI3K/Akt 信号通路的激活，从而导致门脉高压性胃黏膜愈合延迟。PG可以反映胃体黏膜的泌酸功能，胃体萎缩时会影响 PGⅠ的分泌情况〔16,17〕；GAS可以促进胃酸分泌，保护和营养胃肠道黏膜，CAG患者由于胃分泌功能不足，GAS 分泌减少，因此，GAS含量也可以反映胃黏膜萎缩的情况〔18〕。

本研究说明Hp阳性CAG的发病可能与PI3K、Akt、PTEN表达异常有关，PI3K、Akt、PTEN可以通过调控胃黏膜上皮细胞增殖、凋亡等途径参与Hp阳性CAG病变的发生。