加味柴胡疏肝散通过调控AKT/GSK-3β/Nrf2信号通路抑制小鼠酒精性肝损伤

张兆鹏 闫俏 马欣宇 呼雅丽 郭军鹏 刘洋

(1长春中医药大学，吉林 长春 130117；2长春医学高等专科学校)

酒精性肝病(ALD)是一种长期酗酒引起的慢性肝损伤疾病。流行病调查发现，虽然适量饮酒有利于身心健康，如预防心脏病、高血压和糖尿病，但过度和长期饮酒会导致酒精性肝病〔1〕。ALD是全球肝病发病的主要致病因素，并呈逐年上升趋势〔2〕。现代医学对ALD的治疗主要基于戒酒、营养支持、使用护肝药物、改善肝损伤和预防并发症，临床治疗依旧存在一定局限性〔3～6〕。

中医认为，ALD为气、血、痰、湿相互搏结，长久无法及时疏散和排出体外，因此中医治疗多釆用行气、活血、解毒及扶正药配伍〔7，8〕。本研究从中医整体观念出发，基于清解酒毒、化瘀散结的学说，以柴胡疏肝散为基本方配以乌药，行补肝益肾，又兼顾健脾、活血化瘀的功能，共奏降低酒精性肝损伤的功效。目前加味柴胡疏肝散(JWCH)对于酒精性肝损伤的实验研究较少，本研究通过酒精灌胃复制ALD动物模型，探究此方剂对于ALD的保护作用和分子机制。

1 材料和方法

1.1实验动物 40只SPF级昆明小鼠〔辽宁长生生物技术股份有限公司，许可证号：SCXK(辽)2020-0001〕，雌雄各半，体重(22±2)g，饲养于温度为22～ 26℃的实验动物屏障环境中，12 h昼/夜循环照明。

1.2药品和试剂 实验用中药购自长春中医药大学附属医院。三酰甘油(TG)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、活性氧(ROS)、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒购自北京华英生物试剂有限公司，批号分别为(20210622、20210625、20210625、20210627、20210624、20210628、20210625、20210622)；抗体蛋白激酶B(AKT)、p-AKT、核因子NF-E2相关因子(Nrf)2、糖原合成酶激酶(GSK)-3β、p-GSK-3β、β-actin均购自 proteintech生物技术有限公司。

1.3药物制备 根据药典及临床用药剂量可知人用剂量为：陈皮6 g、柴胡6 g、川芎4.5 g、香附4.5 g、枳壳4.5 g、芍药4.5 g、甘草1.5 g、乌药4.5 g。根据人与小鼠体表面积换算得小鼠低、高剂量。水煎煮药材2次，浓缩备用。

1.4造模及给药 小鼠随机分为对照组、模型组、JWCH低剂量(JWCH-L)组、高剂量(JWCH-H)组，每组10只，雌雄各半。除对照组外，其余各组每天定时灌胃给予50°酒精(10 ml/kg)，连续灌胃4 w。第5周开始，对照组和模型组灌胃给予20 ml/kg生理盐水，JWCH-L、JWCH-H组分别灌胃给予50 g/kg、150 g/kg柴胡疏肝散，连续给药2 w。

1.5肝脏指数 造模结束，称量小鼠体重，完整取出肝脏并称量，肝脏指数(%)=肝脏质量(g)/小鼠体重(g)×100%。

1.6血清生化指标 小鼠眼眶静脉丛取血，静置30 min，以3 500 r/min离心15 min，提取上清，严格按照试剂盒说明书，检测TG、ALT、AST、CAT、GSH-Px、ROS、SOD在血清中的含量。

1.7肝组织病理学检查 取部分肝脏，4%多聚甲醛固定，石蜡包埋切片，苏木素-伊红(HE)染色，光学显微镜观察、拍照。

1.8Western印迹检测肝组织相关蛋白表达 取冷冻肝脏组织50 mg，提取组织总蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法定量蛋白浓度。一抗〔AKT(1∶2 000)、p-AKT(1∶2 000)、GSK-3β(1∶2 000)、p-GSK-3β(1∶3 000)、Nrf2(1∶3 000)〕，4℃孵育过夜，二抗(1∶5 000)室温孵育1 h，电化学发光(ECL)显影，图片采用Image J软件进行图片处理分析。

1.9统计学方法 采用SPSS26.0统计学软件进行单因素方差分析和GraphPad Prism8绘图软件处理。

2 结 果

2.1JWCH对ALD小鼠体重和肝脏指数的影响 与对照组比较，模型组体重和肝脏指数明显增加(P<0.05，P<0.01)；与模型组比较，JWCH-L及JWCH-H组体重和肝脏指数明显减小(P<0.05)。见表1。

2.2JWCH对ALD小鼠血清TG、ALT、AST水平的影响 与对照组比较，模型组血清中TG、ALT、AST含量明显升高(P<0.01)；与模型组比较，JWCH-L及JWCH-H组血清中TG、ALT、AST含量明显降低(P<0.05，P<0.01)。见表1。

2.3JWCH对ALD小鼠血清CAT、GSH-Px、ROS和SOD水平的影响 与对照组比较，模型组血清中CAT、GSH-Px、SOD含量明显降低(P<0.05，P<0.01)，ROS含量明显升高(P<0.01)；与模型组比较，JWCH-L及JWCH-H组血清中CAT、GSH-Px、SOD含量明显升高(P<0.05，P<0.01)，ROS含量明显降低(P<0.01)。见表2。

2.4JWCH对ALD小鼠肝脏组织p-AKT、p-GSK-3β、Nrf2蛋白表达影响 与对照组相比，模型组肝脏组织p-AKT、p-GSK-3β、Nrf2蛋白表达量明显降低(P<0.01)；与模型组相比，JWCH各治疗组p-AKT、p-GSK-3β、Nrf2蛋白表达明显增加(P<0.01，P<0.05)。见表2、图1。

表1 JWCH对ALD肝脏指数及TG、ALT、AST含量的影响

2.5JWCH对ALD小鼠肝脏组织HE染色 对照组肝组织结构完整，细胞排列整齐，血窦走行脉络清晰。模型组肝组织可见肝细胞气球样变，出现部分水肿坏死、肝细胞胞质内出现脂肪空泡，肝窦变窄并伴有明显炎性细胞浸润；与模型组相比，JWCH各治疗组肝脏组织上述肝脏病理组织形态改变明显较轻，且部分肝组织损伤恢复明显。见图2。

表2 JWCH对ALD小鼠血清中CAT、GSH-Px、ROS、SOD含量及肝脏组织p-AKT、p-GSH3β、Nrf2蛋白表达的影响

1～4：对照组、模型组、JWCH-L组、JWCH-H组图1 JWCH对ALD小鼠肝脏组织p-AKT、p-GSK3β、Nrf2的蛋白表达

图2 JWCH对ALD小鼠肝脏的影响(HE染色，大图×100，小图×400)

3 讨 论

目前认为，ALD的发生发展机制为酒精在肝脏代谢转换的过程中刺激或激发了肝脏炎症反应和氧化应激反应〔9～11〕。已有研究发现，酒精在肝脏中部分被转化为乙醛，由于体内乙醇脱氢酶的活性比乙醛脱氢酶活性高很多，因此造成乙醛在体内堆积无法快速代谢出体外〔12～14〕。乙醛具有很强的毒性效应，影响肝脏中线粒体呼吸链的正常活动，造成线粒体氧化还原反应障碍，氧自由基生成增多，肝脏氧化应激性损伤加重〔15〕；同时酒精和乙醛还干扰了脂类转运和代谢酶类，造成脂类进入肝脏后不能转运出肝而形成脂肪变性〔16，17〕。

在中医学中，将酒归为湿热品行列，少量饮酒可以促进全身气血畅通，有益于机体健康。但过量饮酒必然会对机体器官造成一定的伤害，累及肝脏及脾胃，导致体内湿热酒毒内藏不散，这也是中医学中ALD病机所在〔18，19〕。柴胡舒肝散是治疗肝脏气血瘀滞、行气活血的代表方。《灵枢·五邪》篇论：“邪在肝，则两胁中痛”，现代医家亦认为气滞、血瘀、湿热而致病机，均可以本方为基础加减治疗〔20〕。有研究表明，该方中柴胡、白芍、川芎具有降低ALD模型血清中ALT、AST、TG水平〔21～23〕。JWCH具有明显升高肝组织中抗氧化物质，有效消除过量自由基及减少炎症的作用〔24〕。

本研究说明，JWCH改善ALD的主要作用机制是通过清除氧自由基或抑制其生成。 酒精对于肝脏的损伤主要通过影响胰岛素受体(INSR)进而影响肝脏的代谢和肝细胞的增殖〔25〕。INSR下游信号通路主要蛋白主要是AKT/GSK-3β〔26〕。AKT/GSK-3β通路的适当激活对于肝脏中能量代谢和细胞存活至关重要〔27，28〕。AKT/GSK-3β通路已被证明可以减轻酒精诱导的肝损伤。大量研究发现，GSK-3β通过将 Nrf2 核转出和磷酸化而下调其功能，Nrf2入核后靶向抗氧化基因启动元件，提高机体抗氧化能力〔29，30〕。本研究发现JWCH能够调节p-AKT、p-GSK-3β和Nrf2蛋白表达，说明AKT/GSK-3β/Nrf2参与了JWCH的肝保护作用。

综上，JWCH对ALD小鼠肝脏具有明显的保护作用，其机制可能与JWCH调节AKT/GSK-3β/Nrf2信号通路、抑制ALD肝脏氧化应激反应有关。