益气活血清热解毒方通过JAK/STAT信号通路对动脉粥样硬化的影响及其分子机制

刘志勇 任德启 郭健 赵彦青 杨明辉 李锋森 成家宏

(1河南中医药大学第二临床医学院，河南 郑州 450046；2河南省中医院)

动脉粥样硬化(AS)是动脉内膜下脂质沉积、平滑肌细胞增生、纤维基质增厚，导致血管壁增厚变硬、失去弹性和管腔缩小的病变，最易受累部位为冠状动脉、脑动脉、肾动脉及下肢动脉〔1〕。AS稳定斑块向易损斑块的转变与心血管疾病事件密切相关，目前认为大多数急性冠脉综合征的发生原因为易损斑块的不稳定、破裂继发血栓形成所致〔2〕。酪氨酸蛋白激酶/信号转导子和转录激活子(JAK/STAT)途径是细胞因子信号转导的重要途径之一，细胞因子与其受体结合后引起受体分子的二聚化，使与受体耦联的JAK相互接近并通过交互的酪氨酸磷酸化而活化，活化的JAKs催化受体本身的酪氨酸磷酸化并形成相应的STATs停靠位点，使STATs通过Src同源2区结构域(SH)2功能区与受体结合并在JAKs的作用下实现其磷酸化活化，然后STATs形成同/异二聚体并入核，与相应的靶基因启动子结合而激活相应的基因转录和表达〔3〕。益气活血清热解毒方是由十几味中药按照不同的含量组成的，在心脏病的治疗中有较好的效果〔4,5〕。本研究探讨益气活血清热解毒方通过JAK/STAT信号通路对AS的影响及其分子机制。

1 材料与方法

1.1动物 6～8周龄载脂蛋白(Apo)E基因缺陷雄性小鼠62只，体重18～20 g，由河南省中医院实验中心提供，饲养条件为二级，室温保持在22～24℃，相对湿度为50%，光照时间为7∶00～19∶00。

1.2材料 高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)检测试盒购自南京建成生物工程研究所；酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒购自上海酶联免疫生物技术有限公司，Trizol试剂、反转录试剂盒、荧光定量试剂盒购自日本TaKaRa公司；引物由上海生工技术人员设计合成。

1.3药物 (1)益气活血清热解毒中药组：由河南中医药大学第二附属医院中药房提供，颗粒剂，太子参15 g，制首乌20 g，水蛭8 g，天麻15 g，胆南星8 g，全蝎8 g，决明子20 g，蜈蚣6 g，桃仁10 g，红花10 g，黄连6 g。溶于70 ml蒸馏水中。(2)益气活血组：脂泰宁胶囊，由河南中医药大学第二附属医院制剂室提供，成人口服6 g/次，2次/d，相当于制首乌20 g，山楂25 g，泽泻15 g，决明子12 g，绞股蓝15 g，取12粒溶于70 ml蒸馏水中。(3)清热解毒组：黄连6 g，由河南中医药大学第二附属医院中药房提供，颗粒剂，溶于70 ml蒸馏水中。(4)辛伐他汀组：辛伐他汀由杭州默沙东制药有限公司生产，20 mg/片，20 mg溶于蒸馏水中。

1.4分组 62只ApoE基因缺陷小鼠分为高脂饮食组(52只)、普通饲料对照组(10只)。对高脂饮食组的52只小鼠建立AS模型。普通饲料对照组给予普通饲料喂养，高脂饮食组给予高脂饲料喂养。12 w后随机抽取高脂饲料ApoE基因缺陷小鼠2只处死，取主动脉经苏木素-伊红(HE)染色光镜观察，确认易损斑块形成。其余50只随机分模型对照组(10只)、益气活血组(10只)、清热解毒组(10只)、辛伐他汀组(10只)、益气活血清热解毒组(10只)。

1.5建立AS模型方法 除普通饲料组隔天腹部皮下0.9%注射生理盐水0.5 ml，并给基础饲料饲养外，其他各组均用自制高脂饲料(含0.15%胆固醇、21.00%脂肪及78.85%基础饲料)喂养，同时隔天腹部皮下注射脂多糖(LPS)剂量为25 μg/0.5(ml·只)，即炎性刺激+高脂饲料法造成AS模型。连续造模周期9 w后，可见小鼠有前肢偏瘫样步态，提示造模成功。

1.6给药 按照1.4处理12 w后，于第13周开始时给药。益气活血组、益气活血清热解毒组、清热解毒组分别给予药液9 ml/(kg·d)体重灌胃(生药相当于成人等效剂量)，辛伐他汀组给予辛伐他汀药液9 ml/(kg·d)体重灌胃。普通饲料对照组和模型对照组给予生理盐水9 ml/(kg·d)。以上各组均连续灌胃8 w。

1.7观察指标 (1)动物一般情况：观察小鼠活动度及对外界反应的灵敏度，皮毛光泽，饮食，二便，死亡情况，每2 w测体重1次。(2)取材前夜禁食，经小鼠眼眶静脉丛采血，离心分离血清，用于测定血脂、超敏C反应蛋白(hs-CRP)、白细胞介素(IL)-6水平。

1.8测定方法 a-actin组化染色：防脱处理的切片脱蜡至水，0.3% H2O2室温15 min灭活内源性过氧化物酶；滴加一抗(1∶300稀释)，4℃过夜；滴加通用型二抗，室温孵育1～2 h；二氨基联苯胺(DAB)显色。利用IPP图像分析软件分别测量并对各个切面的AS斑块面积进行分析，测量斑块面积、血管总面积，计算校正斑块面积(斑块面积/血管总面积)，每个标本取4张切片的平均值。

1.9实时荧光定量(qRT)-聚合酶链反应(PCR)实验 Trizol试剂盒提取小鼠主动脉总RNA，取4 μl总RNA经逆转录酶及随机引物等反应物混合配成20 μl体系，42℃、15 min，95℃、2 min反转录成cDNA，选择β-actin做内对照，进行实时荧光定量PCR。小鼠 IL-6上游引物序列：5′-TGAACTCCTTCTCCACAAGC-3′，下游：5′-ATCCAGATTGGAAGCATCCA-3′；JAK1上游引物序列：5′-GGCAGCCTGTCTACTCTA-3′，下游：5′-TCATCGTCCTTGTAATCC-3′；STAT3上游引物序列：5′-TTTGGAGGCAGGAATAGG-3′，下游：5′-TGGCTTGACGGGTTGAT-3′，细胞因子信号转导抑制蛋白(SOCS)3上游引物序列：5′-CCCGGAGCATGCGCGAGAGC-3′，下游：5′-TGCGGGCTCTGCTGCTGTGG-3′； β-actin上游引物序列5′-GTGCTATGTTGCTCTAGACTTCG-3′， 下游：5′-ATGCCACAGGATTCCATACC-3′。用94℃变性1 min，45℃退火1 min，72℃延伸2 min，循环35轮，进行PCR。最后一轮循环结束后，于72 ℃下保温10 min，使反应产物扩增充分。最后采用2-△△Ct法计算基因相对表达水平。

1.10统计学分析 采用SPSS22.0软件进行t检验、单因素方差分析、LSD-t检验。

2 结 果

2.1各组体重比较 与普通饲料对照组比较，模型对照组体重显著降低(P<0.05)；与模型对照组比较，益气活血组、辛伐他汀组、清热解毒组体重显著升高(P<0.05)；益气活血清热解毒组体重极显著升高(P<0.01)。见表1。

2.2各组血脂水平比较 与普通饲料对照组比较，模型对照组HDL-C水平显著降低，LDL-C、TG、TC水平显著升高(P<0.05)；与模型对照组比较，益气活血组、辛伐他汀组、清热解毒组HDL-C水平显著升高，LDL-C、TG、TC水平显著降低(P<0.05)；益气活血清热解毒组HDL-C水平极显著升高，LDL-C、TG、TC水平极显著降低(P<0.01)。见表1。

2.3各组炎症因子水平比较 与普通饲料对照组比较，模型对照组hs-CRP、IL-6水平显著升高(P<0.05)；与模型对照组比较，益气活血组、辛伐他汀组、清热解毒组hs-CRP、IL-6水平显著降低(P<0.05)；益气活血清热解毒组hs-CRP、IL-6水平极显著降低(P<0.01)。见表1。

表1 各组体重及血脂水平、炎症因子比较

2.4各组斑块面积占血管总面积百分比比较 与普通饲料对照组比较，模型对照组斑块面积显著升高(P<0.05)；与模型对照组比较，益气活血组、辛伐他汀组、清热解毒组斑块面积显著降低(P<0.05)；益气活血清热解毒组斑块面积极显著降低(P<0.01)。见表2。

2.5各组IL-6、JAK1、STAT3、细胞因子信号转导抑制蛋白(SOCS)3基因表达比较 与普通饲料对照组比较，模型对照组IL-6、JAK1、STAT3、SOCS3 mRNA表达水平显著升高(P<0.05)；与模型对照组比较，益气活血组、辛伐他汀组、清热解毒组IL-6、JAK1、STAT3、SOCS3 mRNA表达水平显著降低(P<0.05)；益气活血清热解毒组IL-6、JAK1、STAT3、SOCS3 mRNA表达水平极显著降低(P<0.01)。见表2。

表2 各组斑块面积占血管总面积百分比及IL-6、JAK1、STAT3、SOCS3基因表达比较

3 讨 论

AS疾病是一种慢性多因性疾病，多与年老体虚有关，AS为本虚标实证，虚、痰、瘀、毒为基本致病因素，气阴两虚，痰瘀毒互结为其基本病机，益气活血清热解毒为其基本治法。益气活血清热解毒组中药由太子参、制首乌、水蛭、天麻、胆南星、全蝎、决明子、蜈蚣、桃仁和红花等组成〔6,7〕。陈可冀等〔8〕提出了AS中医“瘀毒”致病理论并进行了相关研究。周明学等〔9〕结果表明，活血、解毒及活血解毒中药有效成分三七总皂苷、黄连提取物、虎杖提取物、大黄醇提取物均可通过改善斑块内部成分来稳定易损斑块，其中兼有活血和解毒作用的中药虎杖提取物、大黄醇提物效果最为显著。

有研究表明，JAK/STAT信号通路与AS的发生发展有密切的关系〔10〕。细胞因子信号转导抑制蛋白(SOCS)不仅是JAK/STAT信号通路的靶基因，也是该通路的负调控因子。Guadalupe等〔11〕研究表明，与野生小鼠相比，ApoE基因缺陷小鼠AS斑块中SOCS1和SOCS3的基因与蛋白表达明显升高；SOCS过度表达可抑制STAT3活性，降低炎症基因表达和细胞增殖，而SOCS基因敲除可加速细胞炎症与增殖反应。Recinos等〔12〕报道，给LDL受体缺陷小鼠高脂饲料喂养并注射血管素Ⅱ诱导动脉粥样硬化斑块易损斑块形成，留取主动脉进行培养，结果发现主动脉外膜的IL-6含量最多，在外膜的IL-6表达明显增高；免疫组化表明，磷酸化的p-STAT3在内膜及中层都有染色，而在LDL受体缺陷与IL-6受体同时缺陷的小鼠P-STAT3在内膜及中层都无染色，说明IL-6在调控位于下游的JAK/STAT3信号表达起重要作用。黄伟彬等〔13〕表明，JAK/STAT信号通路在AS中的作用显著。郝赫等〔14〕表明， IL-6与血管性疾病及AS的进展密切相关，IL-6直接促进主动脉血管平滑肌细胞(VSMC)的增殖，且是通过JAK-STAT信号通路来实现的，而STATl的激活与促炎反应有关。孙伟等〔15〕研究表明，清热解毒类中药对AS有一定的作用。李帅帅等〔16〕研究表明，中医药可以通过干预6条信号通路防治AS的进展。王通渤〔17〕研究表明，各种治疗单从体重上看有效果，大黄素可能从JAK2/STAT3通路发挥一定的作用；与模型组比，中药(大黄素)各剂量组TC、TG、LDL-C的水平均有不同程度下降，高、中剂量中药(大黄素)显著升高HDL-C的水平；与模型组比，中药(大黄素)高、中剂量组IL-6含量和IL-6 mRNA表达明显减少；与模型组比，中药(大黄素)组JAK1 mRNA、STAT3 mRNA表达水平显著下调。

本研究从小鼠体重、血脂、炎症指标评价其稳定易损斑块的作用，从炎症损伤和其关键信号通路IL-6-JAK/STAT3-SOCS3转导的基因分子表达等方面探索益气活血清热解毒组中药稳定易损斑块的分子机制，这对拓展中西医结合防治动脉粥样硬化疾病的理论与临床实践，改善动脉粥样硬化患者的长期预后，具有十分重要的意义。