舒洛地特对糖尿病足溃疡大鼠HIF-1α/GPER/VEGF通路及创面愈合的影响

韦积华 罗富强 谢康麒 李载永 余电柏 麻华德 丁科 罗群强

(右江民族医学院 1附属医院手足外科，广西 百色 533000；2临床医学院)

糖尿病是以高血糖为特征的代谢性疾病，近年来发病人数急剧增加，据国际糖尿病联盟调查显示，全球20～79岁成人群体中糖尿病患者高达4.630亿例，预计2045年可能增长至7.002亿例，其中，我国糖尿病患者例数居全球首位〔1〕。糖尿病患者体内长期的高糖环境会引发大量并发症，糖尿病足溃疡(DFU)是其严重并发症之一〔2〕。研究表明，糖尿病患者长期高血糖会出现不同程度的微血管病变，约15%会引起下肢肢体溃疡，且溃疡难以愈合，15%～20%的DFU患者会发展至截肢，严重影响患者生活质量〔3，4〕。G蛋白耦联雌激素受体(GPER)是近年来发现的膜雌激素受体，可调节多个信号转导通路，在肿瘤中可调控低氧诱导因子(HIF)-1α/血管内皮生长因子(VEGF)通路，诱导微血管环境形成〔5，6〕。有研究发现，定向激活HIF-1对糖尿病小鼠皮肤创伤修复具有促进作用，可能与调控VEGF水平升高有关〔7〕。舒洛地特属于葡糖胺聚糖，主要由80%的低分子肝素和20%的硫酸皮肤素组成，具有抗感染、降血脂、抗心血管疾病等作用，在糖尿病肾病中能保护并重建损伤的血管内皮〔8，9〕。本研究建立DFU大鼠模型，探讨舒洛地特对HIF-1α/GPER/VEGF通路及创面愈合的影响。

1 材料与方法

1.1实验动物及试剂和仪器 雄性SD大鼠，体重200～250 g，购于上海南方模式生物科技股份有限公司，许可证号：SCXK(沪)2017-0010。主要试剂：链脲佐菌素(STZ)、RIPA裂解液(货号：S27190-1g、AR0010-100 ml)购自上海吉至生化科技有限公司；舒洛地特(批准文号：H20140120)购自ALFA WASSERMANN S.p.A.，大鼠白细胞介素(IL)-6、IL-8酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(货号：ZN2880-GPK、ARB12173)购自北京百奥莱博科技有限公司；大鼠肿瘤坏死因子(TNF)-α ELISA试剂盒(货号：ER1393)购自武汉菲恩生物科技有限公司；苏木素-伊红(HE)染色液(货号：DH0006)购自北京雷根生物技术有限公司；HIF-1α抗体、GAPDH抗体、辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG(货号：ab179483、ab186930、ab6721)购自Abcam公司；GPER抗体(货号：NLS4271)购自Novus Biologicals；VEGF抗体(货号：19003-1-AP)购自Proteintech。主要仪器:离心机(型号：5427R)购自德国Eppendorf公司；酶标仪(型号：SynergyH1)购自美国BioTek公司；显微镜(型号：CKX41SF)购自日本Olympus公司；凝胶成像系统(型号：Alpha View)购自美国Protein Simple公司。

1.2动物分组及造模〔10〕大鼠适应性喂养1 w，随机选取8只作为对照组，其余大鼠建立DFU模型。建模大鼠给予高糖高脂饲料喂养，对照组大鼠给予普通饲料喂养。4 w后，建模大鼠按30 mg/kg给予1% STZ溶液(用0.1 mol/L柠檬酸缓冲液配制)腹腔注射1次，对照组大鼠给予等体积0.1 mol/L柠檬酸缓冲液腹腔注射1次。3 d后，测量空腹血糖，空腹血糖>16.7 mmol/L为糖尿病造模成功。此后，建模大鼠改用普通饲料喂养。造模成功的大鼠及对照组大鼠给予10%水合氯醛溶液腹腔注射麻醉，制备溃疡创面：在大鼠双后足背部，用磁铁压出3 mm×7 mm的矩形全层皮肤缺损，达到实验动物创面溃疡的慢性损伤程度即为DFU造模成功。模型大鼠随机分为模型组和舒洛地特低、中、高剂量组，每组8只。

1.3动物给药 造模结束当天分别对舒洛地特低、中、高剂量组大鼠给予5、10、20 mg/kg舒洛地特〔11〕腹腔注射，对照组、模型组给予等体积生理盐水腹腔注射，1次/d，连续给药14 d。给药0、3、7、14 d时，检测大鼠随机血糖。

1.4大鼠创面愈合情况 分别于给药7、14 d对大鼠足背创面拍照，采用Image软件计算其面积，计算创面愈合率。创面愈合率=(初始创面面积-当前测量面积)/初始创面面积×100%。

1.5ELISA检测血清中IL-6、IL-8和TNF-α表达 给药结束后，各组大鼠采集尾静脉血，3 000 r/min离心分离上清液。按照IL-6、IL-8和TNF-α ELISA试剂盒说明书操作，使用酶标仪检测吸光度(OD)值。配制IL-6、IL-8和TNF-α标准溶液，使用酶标仪检测OD值，绘制标准曲线。根据血清样品OD值与标准曲线方程计算血清IL-6、IL-8和TNF-α水平。

1.6HE染色观察创面组织病理变化 各组大鼠剪取创面部位及周围3 mm的组织，用生理盐水冲洗，滤纸吸去水分，分为两份，一份置于-80℃低温保存；另一份用10%甲醛溶液固定，用石蜡包埋后切片，HE染色，显微镜观察创面组织病理变化。

1.7Western印迹法检测创伤组织HIF-1α/GPER/VEGF通路相关蛋白表达 将-80℃低温保存的创面组织于冰上解冻，剪碎，加含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液，在冰上研磨、匀浆，12 000 r/ min离心15 min，分离上清，二喹啉甲酸(BCA)试剂盒测蛋白浓度，取样品与上样缓冲液混合，沸水煮沸5 min使蛋白变性，向十二烷基硫酸钠-聚丙烯酸胺凝胶电泳(SDS-PAGE)凝胶上样孔加高温变性的蛋白样本，电泳、湿转，5%脱脂奶粉封闭2 h，将带有目的蛋白条带的膜放在相应一抗(HIF-1α抗体、GPER抗体、VEGF抗体、GAPDH抗体，均1∶1 000稀释)稀释液中4℃孵育过夜，洗膜，放在二抗(HRP标记的羊抗兔lgG，1∶2 000稀释)稀释液中室温孵育1 h，洗膜，ECL发光显影，凝胶成像系统拍照，分析条带灰度值。

1.8统计学分析 采用SPSS19.0软件进行单因素方差分析、SNK-q检验。

2 结 果

2.1给药过程中各组血糖水平变化 给药0、3、7、14 d，与对照组相比，模型组和舒洛地特低、中、高剂量组血糖水平均显著升高(P<0.05)；给药3、7、14 d，与模型组相比，舒洛地特低、中、高剂量组血糖水平均显著降低(P<0.05)；随着舒洛地特剂量的升高，血糖水平逐渐降低，差异均有统计学意义(均P<0.05)。见表1。

2.2给药过程中各组大鼠创面愈合情况 给药7、14 d，与对照组相比，模型组和舒洛地特低、中、高剂量组大鼠创面愈合率均显著降低(P<0.05)；与模型组相比，舒洛地特低、中、高剂量组大鼠创面愈合率均显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)；随着舒洛地特剂量的升高，大鼠创面愈合率逐渐升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.3各组血清中IL-6、IL-8和TNF-α表达变化 与对照组相比，模型组和舒洛地特低、中、高剂量组大鼠血清中IL-6、IL-8和TNF-α表达水平均显著升高(P<0.05)；与模型组相比，舒洛地特低、中、高剂量组血清中IL-6、IL-8和TNF-α表达水平均显著降低(P<0.05)；随着舒洛地特剂量的升高，血清中IL-6、IL-8和TNF-α表达水平逐渐降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

2.4各组创面组织病理变化 对照组创面组织中存在少量炎症细胞及大量胶原纤维、肉芽组织及新生毛细血管；模型组创面组织中有大量炎症细胞浸润，可见少量胶原纤维沉积及肉芽组织、新生毛细血管生长；随着舒洛地特的使用及剂量的升高，创面组织炎症细胞浸润程度逐渐减轻，胶原纤维沉积及肉芽组织、新生毛细血管数量逐渐增多。见图1。

表1 各组血糖水平及创面愈合率比较

表2 各组血清中IL-6、IL-8和TNF-α表达水平及创面组织中HIF-1α、GPER、VEGF蛋白表达水平比较

图1 各组创面组织病理变化(HE染色，×200)

2.5各组创面组织中HIF-1α/GPER/VEGF通路相关蛋白表达 与对照组相比，模型组和舒洛地特低、中、高剂量组创面组织中HIF-1α、GPER、VEGF蛋白表达水平均显著降低(P<0.05)；与模型组相比，舒洛地特低、中、高剂量组创面组织中HIF-1α、GPER、VEGF蛋白表达水平均显著升高(P<0.05)；随着舒洛地特剂量的升高，大鼠创面组织中HIF-1α、GPER、VEGF蛋白表达水平逐渐升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2、图2。

1～5:对照组、模型组、舒洛地特低剂量组、舒洛地特中剂量组、舒洛地特高剂量组图2 各组创面组织中HIF-1α、GPER、VEGF蛋白表达

3 讨 论

溃疡创面愈合是多种因素共同作用的结果，组织受损愈合时伴有肉芽组织形成，而新生血管是肉芽组织的重要组成部分，通过提供血氧供应在创面愈合过程发挥作用，血管生成数量及生成速度均对创面愈合有影响〔12〕。但血管内皮细胞损伤及功能异常是糖尿病并发血管病变的早期改变之一，会导致血液流通变缓，当糖尿病大鼠出现创伤后，血管内皮细胞增殖积极，但无法有效形成功能毛细血管，影响创面血氧供应，导致创面愈合困难〔13，14〕。本研究结果提示，DFU大鼠模型建立成功，DFU大鼠创伤更难愈合，炎症反应更加严重，且难以生成新生毛细血管。

舒洛地特是临床上的一种新型葡糖胺聚糖制剂，既往报道其具有抑制炎症反应及保护血管内皮细胞的作用〔15，16〕。本研究结果提示，舒洛地特能降低大鼠血糖水平，降低炎症反应，促进创面组织中新生毛细血管生成，能帮助DFU大鼠创面愈合，但涉及的相关作用机制还需进一步探究。

HIF-1α、VEGF均为重要的血管生成生长因子，有助于积极改善糖尿病创面的新生血管形成及愈合效果〔17〕。糖尿病状态对HIF-1α的转录、翻译具有抑制作用，糖尿病创面组织由于相对缺氧，其愈合过程伴随HIF-1α表达的增加，同时HIF-1α表达因高血糖环境而受到抑制，导致糖尿病创面愈合较非糖尿病缓慢〔18〕。本研究结果提示，DFU大鼠体内高血糖环境抑制了发生创伤后的HIF-1α蛋白表达。VEGF是特异性作用于血管内皮细胞的细胞因子，能诱导新生血管形成，同时是HIF-1α的下游基因，可被HIF-1α诱导表达〔19〕。本研究亦发现，DFU大鼠体内高血糖环境会抑制创面组织中VEGF蛋白表达，导致新生毛细血管生成减少。GPER是近年来发现的雌激素受体，在缺血性脑卒中中，其能通过调节HIF-1α表达发挥神经保护作用，在肿瘤中也可调节HIF-1α/VEGF通路诱导形成肿瘤微血管环境〔5，20〕。本研究结果提示，DFU大鼠体内高血糖环境会抑制HIF-1α/GPER/VEGF通路，最终影响创面组织新生毛细血管生成，导致创面愈合变慢。而随着舒洛地特的使用及剂量的升高，舒洛地特可呈剂量依赖性降低血糖水平，减轻高血糖环境对HIF-1α/GPER/VEGF通路的抑制，恢复创面组织新生毛细血管生成。

综上，舒洛地特可降低DFU大鼠血糖水平，同时抑制炎症反应并激活HIF-1α/GPER/VEGF通路，促进创面组织新生毛细血管生成及创面愈合。