芒柄花素对大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响及其机制

卢迎宏 王丹 井海云 王梦超 包晓青

(郑州大学附属郑州中心医院心血管内科，河南 郑州 450007)

心血管疾病在全球范围内均具有较高的病死率，其中急性心肌梗死发病极其凶险，多数患者预后不良〔1〕。目前主要通过溶栓、经皮冠状动脉介入等手段恢复血流，但临床观察发现，心肌缺血后再恢复灌注时，部分患者表现出心肌缺血症状加重，甚至出现大面积坏死的现象，即心肌缺血再灌注损伤〔2〕。因此，减少心肌缺血再灌注损伤是临床医学亟待解决的重难点。芒柄花素是从黄芪、狼麻植物的根中分离提取的一种异黄酮类化合物，又称刺芒柄花素、芒柄花黄素，具有抗肿瘤、降血脂、抗心律不齐、抗菌、解痉挛、抗脂质过氧化、雌性激素等多种药理活性〔3，4〕。研究表明，芒柄花素能改善糖尿病小鼠心肌损伤〔5〕。但芒柄花素是否可以保护心肌缺血再灌注损伤尚不清楚。本研究通过建立心肌缺血再灌注损伤大鼠模型，观察芒柄花素对大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响，并分析其可能机制。

1 材料与方法

1.1实验动物 健康SPF级雄性SD大鼠60只，6～8周龄，体重180～220 g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，动物合格证号：SCXK(沪)2019-0120，各项动物操作均符合3R原则。

1.2药品与主要试剂 芒柄花素(纯度>98%，北京寰宇科创生物科技发展有限公司)，维拉帕米(盐酸维拉帕米片，天津市中央药业有限公司)，磷酸肌酸激酶同工酶(CK-Mb)、肌红蛋白(Mb)、心肌肌钙蛋白(cTn)I、肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-6、IL-1β酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(南京建成生物工程研究所)，苏木素-伊红(HE)染液(上海碧云天生物技术有限公司)，超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物歧化酶(GSH-Px)试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)，蛋白激酶B(Akt)、磷酸化(p)-Akt、细胞内核因子E2相关因子(Nrf)2、p-Nrf2及血红素加氧酶(HO)-1抗体(美国Cell Signaling Technology公司)。

1.3心肌缺血再灌注损伤模型的制备〔6〕采用左冠状动脉前降支结扎法构建心肌缺血再灌注损伤大鼠模型，具体操作如下：腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉大鼠，连接动物呼吸机和心电监护仪，胸骨左缘3～4肋间开口，暴露心脏，于肺动脉圆锥左缘与左心耳下缘2 mm处进针，再经浅层心肌穿出，结扎左冠状动脉前降支30 min，当心电监护仪显示ST段抬高和或T波高耸，且观察到缝线远心端心外膜颜色发绛，提示心肌缺血成功。再松开缝线120 min，若心电监护仪显示ST段下降>50%，心外膜颜色复原，提示心肌缺血再灌注损伤大鼠模型复制成功。

1.4分组与给药 60只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、芒柄花素低、中、高剂量组及维拉帕米组(阳性对照)，每组10只。除假手术组外，其余各组均构建心肌缺血再灌注损伤大鼠模型，假手术组仅暴露心脏、穿线，但不结扎。芒柄花素低、中、高剂量组分别灌胃10、20、40 mg/kg芒柄花素〔7〕，维拉帕米组灌胃20 mg/kg维拉帕米〔8〕，1次/d，连续给药4 w，假手术组和模型组以等体积生理盐水替代。末次给药24 h后，断头法处死大鼠，迅速分离心肌组织，部分固定于4%多聚甲醛液中，剩余冻存于液氮中待测。

1.5观察指标

1.5.1心肌损伤标志物 取心肌组织，以质量∶体积为1∶9添加预冷生理盐水，制备心肌组织匀浆，5 000 r/min离心分离上清液，参照ELISA试剂盒说明书，检测心肌损伤标志物CK-Mb、Mb及cTnI含量。

1.5.2心肌组织病理损伤 取固定的心肌组织，制备4 μm石蜡切片，脱蜡、水化后，进行常规HE染色，脱水、透明、封片，光镜下观察大鼠心肌组织病理损伤情况。

1.5.3炎症因子 取心肌组织，以质量∶体积比为1∶9添加预冷生理盐水，制备心肌组织匀浆，5 000 r/min离心分离上清液，参照ELISA试剂盒说明书，检测心肌组织中炎症因子TNF-α、IL-6及IL-1β含量。

1.5.4氧化应激标志物 以质量∶体积比为1∶9添加预冷生理盐水，制备心肌组织匀浆，5 000 r/min离心分离上清液，根据生化试剂盒说明书，检测氧化应激标志物SOD、MDA及GSH的含量。

1.5.5Akt/Nrf2/HO-1信号通路 取适量心肌组织，添加蛋白裂解液提取总蛋白，检测蛋白浓度后，根据目标蛋白分子量大小选择适宜的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)浓度，电泳至蛋白完全分离后再电转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，然后浸没于含有5%脱脂奶粉的封闭液，室温下反应2 h，接着置于一抗中4℃孵育过夜，分别添加Akt(1∶1 000)、p-Akt(1∶1 000)、Nrf2(1∶500)、p-Nrf2(1∶500)、HO-1(1∶2 000)及内参Actin(1∶1 000)，次日再添加辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔或羊抗鼠二抗(1∶8 000)，37℃反应1 h，最后进行化学发光显影。以p-Akt/Akt、p-Nrf2/Nrf2表示其相对表达量，HO-1条带灰度值与内参Actin条带灰度值比值表示其相对表达量。

1.6统计学方法 采用SPSS17.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1芒柄花素对心肌损伤标志物的影响 与假手术比较，模型组CK-Mb、Mb、cTnI均明显升高(P<0.05)；与模型组比较，维拉帕米组、芒柄花素中、高剂量组CK-Mb、Mb、cTnI均明显降低(P<0.05)，且芒柄花素高剂量组与维拉帕米组上述指标的比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.2芒柄花素对心肌炎症因子水平的影响 与假手术比较，模型组TNF-α、IL-6、IL-1β明显升高(P<0.05)；与模型组比较，维拉帕米组、芒柄花素中、高剂量组TNF-α、IL-6、IL-1β均明显降低(P<0.05)，且芒柄花素高剂量组与维拉帕米组上述指标的比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 芒柄花素对心肌损伤标志物及炎症因子水平的影响

2.3芒柄花素对心肌病理损伤的影响 假手术组心肌细胞形态结构完整，排列整齐；模型组心肌细胞核溶解、固缩，肌纤维紊乱，炎性细胞浸润明显；芒柄花素低、中、高剂量组和维拉帕米组心肌损伤较模型组有明显改善，炎性细胞浸润减少。见图1。

图1 芒柄花素对心肌病理损伤的影响(HE染色，×200)

2.4芒柄花素对氧化应激标志物的影响 与假手术比较，模型组SOD、GSH-Px明显降低，MDA明显升高(P<0.05)；与模型组比较，维拉帕米组、芒柄花素中、高剂量组SOD、GSH-Px明显升高，MDA明显降低(P<0.05)，且芒柄花素高剂量组与维拉帕米组上述指标比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

2.5芒柄花素对Akt/Nrf2/HO-1表达的影响 与假手术比较，模型组p-Akt/Akt、p-Nrf2/Nrf2、HO-1表达明显降低(P<0.05)；与模型组比较，维拉帕米组、芒柄花素中、高剂量组p-Akt/Akt、p-Nrf2/Nrf2、HO-1表达明显升高(P<0.05)，且芒柄花素高剂量组与维拉帕米组上述指标比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2、图2。

表2 芒柄花素对氧化应激标志物及Akt/Nrf2/HO-1表达的影响

1～6：假手术组、模型组、芒柄花素低剂量组、芒柄花素中剂量组、芒柄花素高剂量组、维拉帕米组图2 各组Akt/Nrf2/HO-1表达

3 讨 论

左冠状动脉前降支结扎法是经典的心肌缺血再灌注损伤动物模型，CK-Mb、Mb、cTnI是反映心肌损伤的敏感指标〔9〕，本研究结果提示，芒柄花素可减轻心肌缺血再灌注损伤。目前，心肌缺血再灌注损伤的发病机制尚不完全明了，但炎症因子在其发生发展过程中有关键作用，缺血损伤会刺激中性粒细胞、巨噬细胞等分泌大量的TNF-α、IL-6、IL-1β等促炎因子，这些炎性细胞及因子的聚集会引起血管堵塞。同时，TNF-α还可诱导细胞凋亡，介导过氧化物阴离子促进髓过氧化物酶的合成，从而放大炎症反应，IL-6、IL-1β作为强效的促炎因子，持续升高会进一步加重迅疾损伤〔10，11〕。Yang等〔12〕研究显示，芒柄花素可以过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)α依赖方式，抑制c-Jun氨基末端激酶(JNK)信号通路，减轻炎症反应，改善肝脏胆汁淤积，从而保护肝损伤。本研究中芒柄花素可抑制TNF-α、IL-6、IL-1β的过度表达，提示芒柄花素减轻心肌缺血再灌注损伤可能与减轻炎症反应有关。

同时，心肌发生缺血再灌注损伤时，会产生大量的活性氧，而心肌细胞中富含线粒体，是病理下活性氧的主要来源〔13〕。正常情况下，体内抗氧化和氧化水平处于动态平衡状态，外界刺激引起心肌损伤后，体内分泌的SOD、GSH-Px等抗氧化酶不足以清除体内过多的氧自由基，脂质过氧化，导致氧化反应终末产物MDA明显增加，加剧线粒体损伤〔14〕。本研究结果提示，芒柄花素可减轻氧化应激水平，保护心肌损伤，这与Li等〔15〕报道芒柄花素在创伤性脑损伤中的抗氧化应激作用相似。

磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/Akt通路是机体重要的信号转导通路，多项研究结果均显示，PI3K/Akt信号传导通路在心肌缺血再灌注损伤过程中发挥着重要作用，且很多植物提取物可通过上调PI3K/Akt通路发挥保护心肌的作用〔16，17〕。同时，Akt的活化可增强下游Nrf2活性，促进抗氧化物质HO-1的表达，从而提升细胞的抗氧化作用〔18〕。Aladaileh等〔19〕研究指出，芒柄花素可保护甲氨蝶呤诱导的肾脏损伤，减轻大鼠氧化应激和炎症反应水平，可能与上调Nrf2/HO-1通路有关。本研究发现，心肌缺血再灌注损伤大鼠中Akt/Nrf2/HO-1通路处于抑制状态，芒柄花素给药后可逆转这种抑制，提示芒柄花素可能通过促进Akt/Nrf2/HO-1表达，起到保护心肌损伤的作用。

综上，芒柄花素可保护大鼠心肌缺血再灌注损伤，减轻炎症反应和氧化应激水平，可能与上调Akt/Nrf2/HO-1表达有关，并且以高剂量效果最好。芒柄花素作为一种来源广泛的植物提取物，对心肌缺血再灌注损伤的保护作用将为心缺血性疾病的治疗提供新思路，但其上下游具体调控机制仍有待深入研究。