银杏叶提取物(EGb-761)诱导MDA-MB-231细胞凋亡的分子机制

刘培培 冯赵慧子 严金玲 曾雪亮 潘静 高畅

(1赣南医学院第一附属医院药学部，江西 赣州 341000；2赣州市人民医院康复医学科)

乳腺癌是一种常见于女性的肿瘤〔1〕，根据最新报告显示，2020年乳腺癌全球新发病例高达226万例，超越肺癌成为全球第一大癌症〔2〕。目前，对于乳腺癌转移临床上多采用手术治疗，放化疗辅助术后治疗，但治疗效果较为一般，经常发生肿瘤复发和转移的情况〔3〕，因此，寻找一种防治癌症的复发转移、降低放化疗毒副作用的抗癌药物十分必要。银杏叶提取物(EGb-761)为传统中药材银杏叶中提取的活性成分，具有低毒高效的特点，已有学者将其用于治疗神经损伤、肝损伤及肾代谢等疾病〔4，5〕，但银杏叶提取物对肿瘤尤其是人乳腺癌治疗效果的研究报道较少，其分子机制尚不十分明确。磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)通路和细胞活动密切相关，已被研究证实与多种人类肿瘤存在关联，其活性异常会使细胞周期紊乱，导致正常细胞向肿瘤细胞转换〔6，7〕。本研究观察EGb-761对人乳腺癌MDA-MB-231细胞的影响，并基于PI3K/Akt通路探讨EGB-761抗肿瘤作用的机制。

1 材料与方法

1.1细胞株与EGb-761 MDA-MB-231细胞(购自协和细胞库)；EGb-761(17.5 mg/5 ml，台湾济生化学制药厂股份有限公司，批号：M4073)。

1.2试剂与仪器 RPMI1640培养基、青链霉素购自同田科技有限公司；蛋白胰酶购自GEN-VIEW科技有限公司；标准胎牛血清购自爱必信生物有限公司；噻唑蓝(MTT)试剂盒、transwell小室、基质胶、凋亡检测试剂盒购自美国Thermo公司；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)-3、腺苷二磷酸-核糖聚合酶(PARP)、糖原合成酶激酶(GSK)-3β、p-GSK-3β、PI3K、p-Akt 、Akt和β-actin抗体及山羊抗兔IgG购自成都正能生物有限公司；Elx800酶标仪购自BioTek公司；Western 湿电转膜仪购自美国BD公司；S3e流式细胞仪购自美国Thermo公司；荧光倒置显微镜购自美国Leica公司。

1.3细胞培养及分组 MDA-MB-231细胞在培养基中(含10%胎牛血清，1%的青链霉素)，于37℃、5%CO2温箱中孵育，2～3 d传代1次，3代后用于实验。根据银杏叶提取物EGb-761处理的浓度分为低(656.25 μg/ml)、中(1 093.75 μg/ml)、高浓度(1 531.25 μg/ml)组，以不含EGb-761的溶剂处理细胞为对照组。

1.4MTT法检测MDA-MB-231细胞抑制率 取对数期细胞，浓度控制为1×105个/ml。对照组和EGb-761组每孔加入100 μl细胞悬浮液，调零组加培养基，小孔周围加PBS，于5%CO2，37℃培养箱中孵育24 h。根据分组加药处理，调零组加等量培养基，继续培养24 h。各组加MTT溶液20 μl，继续孵育4 h。吸出上清，每孔200 μl二甲基亚砜(DMSO)，振荡10 min，使结晶物充分融解，上酶标仪测定各孔光OD490 nm值，记录结果并计算各复孔的细胞抑制率，每组设5个复孔。细胞抑制率=(OD对照-ODEGb-761)/(OD对照-OD调零)×100%。

1.5细胞迁移实验 取对数期细胞，0.25%胰酶消化，离心，重悬细胞，调整细胞密度为2×105/ml。按上述细胞分组处理，上室加入100 μl处理好细胞悬液，下室加入含20%血清的培养基，放5% CO2，37℃培养箱中孵育24 h。取出小室，吸去溶液，4%甲醛固定细胞10 min，0.1%结晶紫染色10 min左右，清洗。用棉签小心擦去上室底部膜表面上的细胞，取5个方向随机视野，显微镜下计数，计算取平均值。

1.6细胞侵袭实验 取稀释的人工基质胶125 μl加入transwell板上室，平摊覆盖至膜上，然后在温箱中放置30 min，使人工基质胶聚合。取对数期待测细胞，调整浓度为2×105个/ml，上室接种处理后MDA-MB-231细胞悬液，下室用初始的培养基做趋化因子。后续步骤同1.5迁移实验，显微镜下计数，计算取平均值。

1.7倒置显微镜下形态观察 取对数期细胞，接种于24孔板并控制密度为1×105个/孔，培养细胞，按1.3描述方法进行分组处理，继续培养48 h，显微镜下观察乳腺癌细胞形态。

1.8双染法检测细胞凋亡 取对数期细胞，接种到6孔板中，每孔约2×105个细胞。置于温箱中，根据分组处理，继续培养48 h。以0.25%胰酶消化细胞，离心后弃上清。4℃预冷的70%乙醇固定，调整细胞浓度为1×106个/ml，加入染色剂10 ml，置于4℃冰箱中染色30 min，流式细胞仪检测凋亡情况，细胞凋亡率(%)=凋亡细胞/细胞总数×100%计算。

1.9Western印迹检测PI3K/Akt通路蛋白表达 取对数期细胞同上处理分组，培养48 h，收集各组细胞加入细胞液裂解15 min，用二喹啉甲酸(BCA)试剂盒测定蛋白浓度。将样品放在沸水中加热至蛋白完全变性，拿出样品冷却至室温，取30 μg进行电泳，湿转聚偏氟乙烯(PVDF)膜。常温下以5%脱脂牛奶封闭2 h，后用TBST清洗3次，一抗caspase-3、PARP、p-GSK-3β、GSK-3β、PI3K、p-Akt、Akt(1∶1 000)4℃孵育过夜，洗膜，DyLight 800标记的二抗(1∶2 000)常温下孵育1 h，PVDF清洗膜3次后，用化学发光法进行显影处理，拍照，用ImageJ(v1.7.0)软件对实验所得条带进行定量分析，以β-actin作为内参蛋白，相对表达量=目标蛋白灰度值/参照蛋白灰度值。

1.10统计学方法 采用SPSS21.0软件进行单因素方差分析、LSD-t检验。

2 结 果

2.1EGb-761对细胞抑制率的影响 对照组和EGb-761低、中、高组的抑制率依次为(0.00±0.00)%、(27.28±5.66)%、(48.05±4.90)%、(80.30±4.00)%，各组差异均有统计学意义，且EGb-761对DA-MB-231细胞抑制作用呈浓度依懒性(均P<0.05)。

2.2EGb-761对细胞迁移的影响 对照组和EGb-761低、中、高组的迁移个数分别为(379.40±27.46)个、(348.80±17.08)个、(288.00±16.23)个、(224.00±11.38)个，与对照组比较，EGb-761各剂量组细胞穿透数量显著减少，且呈剂量依赖，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图1。

2.3EGb-761对细胞侵袭能力的影响 对照组和EGb-761低、中、高组的细胞数分别为(272.60±15.37)个、(208.80±16.21)个、(127.20±11.12)个、(69.80±10.66)个。与对照组比较，EGb-761组细胞侵袭数量明显减少，且呈剂量依赖，差异均有统计学意义(均P<0.05)，见图1。

2.4EGb-761对细胞形态的影响 对照组MDA-MB-231细胞为细长不规则状，间隙较小，分布密集。加入EGb-761培养48 h后，细胞间隙增大，密度显著降低，贴壁生长细胞开始脱壁，胞质出现浑浊，细胞外形收缩呈片状球状，出现细胞肿胀破裂情况，提示处理后细胞会明显发生凋亡，见图2。

2.5EGb-761对细胞凋亡的影响 对照组和EGb-761低、中、高组的细胞凋亡率分别为(2.15±0.41)%、(23.23±2.07)%、(44.69±4.12)%，(65.78±5.26)%。与对照组比较，EGb-76组细胞凋亡率明显升高，且呈剂量依赖性，差异均有统计学意义(均P<0.05)，见图3。

2.6各组PI3K/Akt通路蛋白水平测定 与对照组比较，EGb-761处理后各组PARP和PI3K蛋白含量均明显降低，caspase-3含量显著升高，p-GSK-3β和p-Akt水平显著下降，且EGb-761剂量越高效果越显著(均P<0.05)。见表1、图4。

图1 各组细胞迁移及侵袭(结晶紫染色，×200)

图2 各组MDA-MB-231细胞细胞形态变化(结晶紫染色，×200)

图3 各组细胞凋亡率

表1 各组PI3K/Akt通路蛋白表达

1～4：对照组、EGb-761低浓度组、EGb-761中浓度组、EGb-761高浓度组图4 各组PI3K/Akt通路蛋白Western印迹检测

3 讨 论

细胞的增殖和凋亡是非常重要的生理过程，正常情况下细胞的增殖会受到自身限制，细胞凋亡表现稳定。但在癌细胞中这些平衡会被打破，细胞增殖速度异常并失去控制，凋亡途径被阻断，使得癌细胞非常具有危险性〔8〕。

在分子层面上，PI3K/Akt通路参与调节多种细胞生理功能，而乳腺癌的产生和细胞活动的异常存在直接的关系，二者之间存在的一定的联系〔9，10〕。PI3K 是一种异源二聚体酶，多种信号因子都可以使PI3K活化〔11，12〕。活化的PI3K通过特异性催化激活胞膜上的PIP3，从而靶向调控Akt。Akt是PI3K重要的下游效应蛋白〔13〕，活化后的Akt可以通过作用于PARP、GSK-3β、caspase-3等因子，进而调节细胞的功能，与肿瘤的形成发展有紧密的关联〔14，15〕。作为PI3K/Akt的下游分子的PARP蛋白是一种DNA修复酶，在细胞凋亡调控中发挥着十分重要的作用，其主要通过内源性途径调节细胞凋亡，PARP的剪切与caspase-3活化也存在密切关联。caspase-3在细胞凋亡有着重要的作用，研究表明，PI3K/Akt信号通过caspase-3蛋白，引起促凋亡蛋白B细胞淋巴瘤-2相关X蛋白(Bax)从细胞质向线粒体外膜移位，破坏线粒体膜的完整性，降低膜电位，使得细胞开始凋亡。GSK-3β是一种普遍存在细胞中的调控糖原合成酶，活化的GSK-3β蛋白作用与多种信号分子，可以调节细胞的多种生命活动，但在在肿瘤细胞中GSK-3β代谢会产生异常，使得机体紊乱。有研究表明，PI3K/Akt信号通过caspase-3蛋白〔16〕。

本研究结果说明，EGb-761通过PI3K/Akt信号通路下调肿瘤细胞中PARP和PI3K的表达，上调caspase-3的表达，进而诱导MDA-MB-231细胞的凋亡。EGb-761中的主要有效成分为银杏黄酮类化合物。研究认为，包括EGb-761在内的多种黄酮类化合物具有抗氧化作用，同时可以影响体内金属离子平衡，调节代谢状态，近几年随着研究愈加深入，发现EGb-761在分子水平上也有巨大的影响作用，可以调控多个信号通路〔17〕。亢璐等〔18〕研究发现，EGb761可以通过血管内皮生长因子(VEGF)/PI3K/Akt1通路清除氧自由基，从而改善大鼠创伤性脑水肿；刘铁钢等〔19〕在报告中指出，EGb-761对甲状腺癌TPC-1细胞株的抗肿瘤效果与调控PI3K/Akt信号通路密切相关〔19〕。在EGb-761所属的黄酮类化合物研究中也有相应的结果，韦飞燕等〔20〕研究说明黄酮类中药单体被证实具有显著的抗肿瘤活性，具有诱导凋亡和自噬、抑制增殖和转移的作用，内在机制可能与多个通路相关，其中就包括PI3K/Akt 途径。而关于人乳腺癌的研究中，López-Knowles等〔21〕通过实验证明PI3K通路可以有效抑制肿瘤细胞；Jie等〔22〕则在研究报告中指出，抑制PI3K和Akt的活化可以有效的促进乳腺癌细胞的凋亡。本研究发现EGb-761影响乳腺癌细胞的增殖、迁移、侵袭、凋亡过程，与其他人在不同类型细胞中的研究结果相似，同时，发现EGb-761通过PI3K/Akt途径调控多种蛋白的表达和活化，作用与MDA-MB-231的生命活动。

综上，EGb-761通过调控PI3K/Akt途径扼制MDA-MB-231细胞增殖，诱导其凋亡，具有较好的抗肿瘤作用，其机制可能是通过抑制PI3K及Akt的磷酸化，抑制下游蛋白表达，并诱导MDA-MB-231细胞凋亡。本研究为体外试验，对EGb-761在生物体内的功效未做探讨，能否被机体利用且具体临床疗效，还需要进一步的实验研究验证。