circ_POLA2靶向miR-330-5p对脑胶质瘤细胞生长及转移能力的影响

罗方接 张代龙 邓景阳 陈亚德 曾志明 祝展鹏

(东莞市松山湖中心医院神经外科，广东 东莞 523320)

脑胶质瘤具有恶性程度高与侵袭性强等特点，患者5年生存率较低，目前脑胶质瘤的发病机制尚未阐明〔1,2〕。环状RNA(circRNA)是由5′端与3′端以共价键形成的闭合环状RNA分子，其不易被RNaseA降解且具有组织特异性、稳定性等特点，已知circRNA在脑胶质瘤中表达异常，并可充当微小RNA(miRNA)的海绵分子而负向调控miRNA的表达进而调节脑胶质瘤细胞增殖、凋亡等生物学行为〔3,4〕。circ_POLA2在肺癌细胞中表达上调，其可通过调控miR-326/GNB1轴而促进肺癌细胞增殖及转移〔5〕。但circ_POLA2与脑胶质瘤的相关报道研究相对较少。Circular RNA Interactome预测显示circ_POLA2与miR-330-5p存在结合位点，研究表明miR-330-5p在脑胶质瘤细胞中表达下调，上调其表达可抑制细胞增殖〔6〕。但circ_POLA2/miR-330-5p轴在脑胶质瘤发生及发展过程中的作用机制尚未可知。本研究主要探讨circ_POLA2是否可通过靶向调控miR-330-5p而影响脑胶质瘤细胞生长及转移。

1 材料与方法

1.1材料与试剂 收集2019年1月至2020年5月东莞市松山湖中心医院脑科手术切除的46例脑胶质瘤组织及其癌旁组织标本，其中男26例，女20例，年龄50～68岁，平均(55.49±6.77)岁，所有患者为初次诊治患者且经手术病理证实为脑胶质瘤，患者术前均为接受放化疗治疗。本研究已通过医院伦理委员会批准，患者知情且签署同意书。人脑胶质瘤细胞T98G购自武汉普诺赛生命科技有限公司；DMEM培养基购自美国Hyclone；胎牛血清购自美国Gibco；Lipofectamine2000购自美国Invitrogen；Trizol试剂、逆转录试剂与荧光定量PCR试剂购自美国Thermo Fisher；circ_POLA2小分子干扰RNA(si-circ_POLA2)及阴性对照(si-NC)、miR-330-5p寡核苷酸模拟物(miR-330-5p mimics)及阴性对照mimic NC序列(miR-NC)、miR-330-5p特异性寡核苷酸抑制剂(anti-miR-330-5p)及其阴性对照(anti-miR-NC)购自广州锐博生物；pcDNA、pcDNA-circ_POLA2购自广州复能基因；CCK-8、基质胶、Transwell小室购自北京索莱宝；葡萄糖消耗量购自北京普莱利基因；乳酸检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；兔抗人基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9单克隆抗体与辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG二抗购自美国Santa Cruz。

1.2方法

1.2.1实验分组 T98G细胞按照每孔1×104个细胞的密度接种于6孔板，用不含胎牛血清的培养基分别稀释转染物：si-NC、si-circ_POLA2、miR-NC、miR-330-5p mimics、si-circ_POLA2与anti-miR-NC、si-circ_POLA2与anti-miR-330-5p，充分混匀后室温孵育5 min，用不含胎牛血清的培养基稀释Lipofectamine2000转染试剂，分别将Lipofectamine2000稀释液与转染物稀释液充分混匀室温静置20 min，将二者混合溶液按照每孔400 μl的密度加入6孔板，6 h后弃旧培养基并更换为DMEM新鲜培养基，于培养箱内继续培养48 h，分别记为si-NC组、si-circ_POLA2组、miR-NC组、miR-330-5p组、si-circ_POLA2+anti-miR-NC组、si-circ_POLA2+anti-miR-330-5p组。

1.2.2实时荧光定量-聚合酶链反应(qRT-PCR)检测circ_POLA2、miR-330-5p的表达水平 用Trizol试剂提取组织标本与T98G细胞总RNA，根据逆转录试剂盒进行逆转录合成cDNA，SYBR Green PCR试剂用于进行qRT-PCR，反应体系：SYBR Green Master Mix 10 μl，正反向引物0.8 μl，cDNA 2 μl，ddH2O补足体系至20 μl；反应条件：95℃预变性2 min，95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40次循环。用2-ΔΔCt法计算circ_POLA2、miR-330-5p相对表达量。

1.2.3CCK-8实验检测细胞增殖 取各组T98G细胞(2×105个/ml)接种于96孔板(100 μl/孔)，于培养箱内分别培养24、48、72 h时加入20 μl CCK-8溶液，于培养箱内继续孵育2 h，用酶标仪检测各孔在450 nm处的吸光度值(OD)。

1.2.4检测葡萄糖消耗量、乳酸生成量 收集各组T98G细胞培养基，用葡萄糖检测试剂盒检测葡萄糖浓度，葡萄糖消耗量=培养基本底葡萄糖浓度-实验组培养基葡萄糖浓度；用乳酸检测试剂盒检测乳酸浓度，乳酸生成量=培养基本底乳酸浓度-实验组培养基乳酸浓度。

1.2.5划痕实验 6孔板内接种各组T98G细胞悬液(1×105个/孔)，用标记笔在6孔板后面划横线(间隔0.5～1.0 cm)，于培养箱内培养24 h，用移液枪枪头比对直尺垂直横线划痕，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞后加入不含血清的培养基，于培养箱内培养0 h与24 h取样拍照〔划痕愈合率(%)=(0 h划痕宽度-24 h划痕宽度)/0 h划痕宽度×100%〕。

1.2.6Transwell实验检测侵袭 基质胶稀释液加入小室的上室(40 μl/孔)，于培养箱内孵育5 h后加入各组T98G细胞(1×104个/孔)，下室加入600 μl含有10%胎牛血清的培养液，于培养箱内培养48 h后取出小室，用棉签除去膜表面残留，PBS洗涤后用甲醇固定20 min，弃甲醇后加入0.1%结晶紫染色液染色20 min，于显微镜下观察并拍照(取5个视野细胞数平均值)。

1.2.7荧光素酶报告基因实验及RNA免疫沉淀(RIP)检测circ_POLA2与miR-330-5p的靶向关系 根据psiCHECK2载体酶切位点设计合成野生型WT-circ_POLA2与突变型MUT-circ_POLA2并分别连接于psiCHECK2载体，扩增后提纯，分别将WT-circ_POLA2、MUT-circ_POLA2与miR-NC、miR-330-5p mimics共转染至T98G细胞，培养48 h后检测细胞荧光素酶活性。RIP实验：取T98G细胞加入RIPA裂解液裂解细胞，收集上清后加入800 μl NT-2缓冲液，依次分别加入Argonaute RISC催化组分(Ago)2抗体(20 μg)或免疫球蛋白(Ig)G抗体(20 μg)，同时取出10 μl样品作为Input备份，置于-80 ℃冰箱内保存，抗体孵育3 h后离心10 min，冰上孵育1 min，弃上清，加入2×蛋白上样缓冲液(10 μl)，沸水煮5 min，冰上孵育1 min，获得沉淀即成为RIP沉淀，用qRT-PCR法检测RIP沉淀中circ_POLA2与miR-330-5p的表达量。

1.2.8Western印迹检测MMP-2、MMP-9蛋白表达 收集各组T98G细胞加入细胞裂解液后于4℃摇床上孵育30 min，4℃条件下经12 000 r/min转速离心10 min，取上清液即为总蛋白，配制10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，检测蛋白浓度后加入上样缓冲液煮沸变性，按照每孔20 μl的密度加入上样孔，目的蛋白分离后终止电泳，转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，用5%脱脂奶粉封闭1 h，MMP-2(1∶1 000)、MMP-9(1∶1 000)与GAPDH(1∶2 000)抗体溶液孵育PVDF膜过夜，次日，室温孵育二抗(1∶5 000)1 h，加入化学发光剂后于凝胶成像系统中曝光，用ImageJ软件分析各条带灰度值。

1.3统计学处理 采用SPSS21.0软件进行t检验、方差分析、Pearson相关分析。

2 结 果

2.1circ_POLA2与miR-330-5p在脑胶质瘤组织中的表达及其相关性 与癌旁组织比较，脑胶质瘤组织中circ_POLA2表达明显升高，miR-330-5p的表达明显降低(P<0.05)，见表1。circ_POLA2与miR-330-5p呈负相关(r=-0.896 4，P<0.001)。

2.2干扰circ_POLA2表达对T98G细胞增殖及糖酵解水平的影响 与si-NC组比较，si-circ_POLA2组细胞活力、葡萄糖消耗量和乳酸生成量明显降低(P<0.05)，见表2。

表1 circ_POLA2与miR-330-5p在脑胶质瘤组织中的表达

表2 干扰circ_POLA2表达对T98G细胞糖酵解水平的影响

2.3干扰circ_POLA2表达对T98G细胞迁移及侵袭的影响 与si-NC组比较，si-circ_POLA2组划痕愈合率和MMP-2、MMP-9蛋白水平明显降低(P<0.05)，侵袭细胞数明显减少(P<0.05)，见图1、表3。

图1 Western印迹检测MMP-2、MMP-9蛋白表达

表3 干扰circ_POLA2表达对T98G细胞迁移及侵袭的影响

2.4circ_POLA2靶向调控miR-330-5p circ_POLA2与miR-330-5p存在结合位点，见图2。miR-330-5p过表达可明显降低野生型载体WT-circ_POLA2的荧光素酶活性(P<0.05)，而未能抑制MUT-circ_POLA2的荧光素酶活性，见表4。RIP实验证实circ_POLA2可结合miR-330-5p，见表5。与pcDNA组(1.00±0.04)比较，pcDNA-circ_POLA2组miR-330-5p表达量明显降低(0.38±0.04，P<0.05)；与si-NC组(1.00±0.05)比较，si-circ_POLA2组miR-330-5p表达量明显升高(2.28±0.17，P<0.05)。

图2 Circular RNA Interactome预测显示circ_POLA2与miR-330-5p存在结合位点

表4 双荧光素酶报告基因实验结果

表5 RIP实验结果

2.5miR-330-5p过表达对T98G细胞增殖、糖酵解水平、迁移及侵袭的影响 与miR-NC组比较，miR-330-5p组细胞活力、葡萄糖消耗量、乳酸生成量、划痕愈合率和MMP-2、MMP-9蛋白水平明显降低，24、72 h侵袭细胞数明显减少(均P<0.001)，见表6、图3。

表6 miR-330-5p过表达对T98G细胞糖酵解水平、迁移及侵袭的影响

图3 miR-330-5p过表达对T98G细胞增殖及MMP-2、MMP-9蛋白表达量的影响

2.6抑制miR-330-5p表达部分逆转干扰circ_POLA2对T98G细胞增殖、糖酵解水平、迁移及侵袭的抑制作用 与si-circ_POLA2+anti-miR-NC组比较，si-circ_POLA2+anti-miR-330-5p组细胞活力、葡萄糖消耗量、乳酸生成量、划痕愈合率、MMP-2、MMP-9蛋白水平明显升高，侵袭细胞数明显增多(均P<0.001)，见图4、表7。

1，2：si-circ_POLA2+anti-miR-NC组,si-circ_POLA2+anti-miR-330-5p组图4 抑制miR-330-5p表达部分逆转干扰circ_POLA2对T98G细胞增殖及MMP-2、MMP-9蛋白表达量的作用

表7 抑制miR-330-5p表达部分逆转干扰circ_POLA2对T98G细胞糖酵解水平、迁移及侵袭的抑制作用

3 讨 论

circRNA属于新型非编码RNA分子，主要分为外显子circRNA、内含子circRNA等，其广泛存在于机体内，既往研究显示circRNA在脑胶质瘤中表达上调或下调，并可能作为脑胶质瘤诊断及治疗的潜在靶点，例如，circ-SMAD7通过上调PCNA促进脑胶质瘤细胞增殖和转移〔7〕。circSCAF11通过miR-421/SP1/VEGFA轴促进脑胶质瘤的发生〔8〕。CircZNF60/miR-134-5p/BTG-2轴可促进神经胶质瘤细胞的增殖和迁移〔9〕。circ-MAPK4通过充当miR-125a-3p的海绵分子而调控MAPK信号通路进而抑制脑胶质瘤细胞凋亡〔10〕。circ_0008225通过充当miR-890的海绵分子而促进ZMYND11表达进而抑制脑胶质瘤发生及发展〔11〕。

circ_POLA2在宫颈鳞状细胞癌中呈高表达，其可通过调控miR-326/GNB1轴而促进宫颈鳞状细胞癌细胞增殖、迁移及侵袭〔12〕。但circ_POLA2在脑胶质瘤中的表达及其可能作用机制尚未可知。本研究结果提示，干扰circ_POLA2表达抑制脑胶质瘤细胞增殖。有氧糖酵解主要是指在氧气充足时肿瘤细胞葡萄糖代谢是以糖酵解为主，当葡萄糖转变为乳酸后可产生三磷酸腺苷而满足肿瘤细胞对能量的需求，糖酵解可为肿瘤细胞生物大分子合成提供物质基础，还可促进肿瘤细胞增殖、迁移及侵袭，研究显示有氧糖酵解是脑胶质瘤细胞增殖及转移的重要原因之一〔13〕。本研究结果提示，干扰circ_POLA2表达可能通过降低脑胶质瘤细胞糖酵解水平而抑制细胞增殖进而抑制脑胶质瘤发展进程。MMP-2、MMP-9属于基质金属蛋白酶，其可降解细胞外基质沉积而促进细胞转移〔14〕。本研究结果提示，干扰circ_POLA2表达可抑制脑胶质瘤细胞迁移及侵袭。

本研究结果提示，circ_POLA2可能通过吸附miR-330-5p而参与脑胶质瘤发生发展过程。研究表明miR-330-5p通过靶向ITGA5抑制胶质母细胞瘤细胞增殖和侵袭〔15〕。circ_0008532通过调节miR-155-5p/miR-330-5p/MTGR1轴促进膀胱癌的进展〔16〕。circSFMBT1通过靶向miR-330-5p/PAK1轴促进胰腺癌的生长和转移〔17〕。circ_0025033通过调节miR-330-5p/KLK4轴促进卵巢癌的发展〔18〕。表明miR-330-5p在肿瘤中呈低表达，并可能发挥抑癌基因作用，同时miR-330-5p基因序列上含有多个circRNA的结合位点，即多个circRNA可能通过吸附miR-330-5p而参与肿瘤发生及发展过程。本研究结果提示circ_POLA2可通过靶向miR-330-5p而促进脑胶质瘤细胞生长及转移。