响应面法优化粘质沙雷氏菌产灵菌红素发酵工艺

何镇权，李 静，邓毛程，张远平，王 瑶，杨 姬，苏佳豪，漆祖粵，钟海婷

（广东轻工职业技术学院 食品与生物技术学院，广东 广州 510300）

灵菌红素是一种来源于微生物的次级代谢产物，是具有三个吡咯环为骨架结构的红色素[1]，灵菌红素具有抗菌、抗疟、抗肿瘤等作用，可诱导T、B淋巴细胞凋亡，引起了医学、制药和不同行业研究人员的兴趣[2-3]，已从多个角度对灵菌红素及其合成菌的特性进行深入研究，如对病原微生物的抑菌活性、合成菌的细胞运动、产物转录合成调控等[4-5]，尤其在诱导癌细胞凋亡方面具有特殊作用机制，被认为是一种具有巨大开发潜力的抗癌药物[6-7]。

灵菌红素最早发现由粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）产生，近年来也有产自链霉菌属（Streptomyces）、弧菌属（Vibrio）、恶臭单胞菌（Pseudomonas putida）的报道，至今人们普遍利用粘质沙雷氏菌进行灵菌红素生物合成的研究[8-10]。刘思航等[11]通过正交试验法优化粘质沙雷氏菌的发酵培养基和发酵条件，使灵菌红素产量提高了2.845倍；洪伟等[12]通过响应面法对粘质沙雷氏菌发酵的甘油添加量、胰蛋白胨、摇床转速等因素进行优化，使灵菌红素产量较初始状态提高了24倍。灵菌红素是微生物的次级代谢产物[6]，培养基的磷酸盐用量往往会影响次级代谢产物的生物合成。本研究在灵菌红素高产菌种筛选的前期研究基础上，通过响应面法对培养基磷酸盐用量、溶氧量、发酵时间等因素进行优化，期望能够提高粘质沙雷氏菌的灵菌红素发酵水平，为相关研究及生产实践提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌株与试剂

粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）PG12：现保藏于广东轻工职业技术学院微生物实验室；大豆油：中粮福临门食品营销有限公司；灵菌红素标准品（纯度＞98%）：上海源叶生物科技有限公司；K2HPO4、MgSO4·7H2O（均为分析纯）：天津永大化学试剂有限公司；蛋白胨、酵母膏（均为生化试剂）：广东环凯微生物科技有限公司。

1.1.2 培养基

种子培养基：葡萄糖32 g/L，蛋白胨12 g/L，酵母膏8 g/L，K2HPO430 mmol/L，MgSO4·7H2O 0.45 g/L，调节pH值为7.0，121 ℃灭菌20 min。

发酵培养基：大豆油30 g/L，蛋白胨12 g/L，K2HPO420～45 mmol/L，MgSO4·7H2O 0.45 g/L，调节pH值为7.5，121 ℃灭菌20 min。

1.2 仪器与设备

ZHWY-C2112F双层恒温摇床：上海智城分析仪器制造有限公司；GJS-30D型全自动发酵罐：江苏省镇江贝利生物工程有限公司；RE-52A型旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；TL-1000CT型超声波细胞破碎仪：江苏恒敏仪器制造有限公司；H1850R型高速离心机：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；U-T6型紫外可见分光光度计：屹谱仪器制造（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 粘质沙雷氏菌活化及种子液制备

将粘质沙雷氏菌PG12的斜面菌种接入200 mL种子培养基，于26 ℃、200 r/min的振荡生化培养箱中培养10 h。将200 mL种子培养液接入20 L发酵培养基，按单因素试验和响应面试验的方案进行发酵。

1.3.2 菌株产灵菌红素发酵工艺条件优化单因素试验

（1）K2HPO4浓度对灵菌红素产量影响

将发酵培养基中K2HPO4浓度分别调节为20 mmol/L、25 mmol/L、30 mmol/L、35 mmol/L、40 mmol/L、45 mmol/L，在发酵温度26 ℃、pH7.5、溶氧量60%的条件下发酵36 h，检测灵菌红素产量。

（2）溶氧量对灵菌红素产量影响

将发酵培养基中K2HPO4浓度调节为30 mmol/L，控制发酵温度26 ℃和pH7.5，分别控制溶氧量为15%、30%、45%、60%、75%，发酵36 h，检测灵菌红素产量。

（3）发酵时间对灵菌红素产量影响

将发酵培养基中K2HPO4浓度调节为30 mmol/L，控制发酵温度26 ℃、pH7.5、溶氧量60%，分别发酵18 h、24 h、30 h、36 h，检测灵菌红素产量。

1.3.3 发酵工艺条件优化响应面试验

在上述单因素试验基础上，根据Box-Behnken试验设计原理[13-14]，选择K2HPO4浓度（X1）、溶氧量（X2）、发酵时间（X3）为自变量，以灵菌红素产量（y）为响应值，通过3因素3水平的响应面分析设计，对粘质沙雷氏菌PG12发酵产灵菌红素条件进行优化，试验因素水平设计见表1。

表1 菌株PG12产灵菌红素发酵工艺条件优化响应面试验因素及水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments for fermentation process conditions optimization for prodigiosin production by strain PG12

1.3.4 灵菌红素含量测定

配制一系列浓度的灵菌红素标准溶液，在波长535 nm处测定吸光度值[15]，建立灵菌红素标准曲线回归方程（y=0.195 6x+0.005 3，R2=0.998 6）。参照文献所述的灵菌红素提取方法，取100 mL发酵液，利用超声波细胞破碎仪在功率150 W条件下进行超声波破碎处理15 min，在50 ℃下减压蒸发去除水分，加入适量的、pH 3.0的甲醇，使色素溶解，经离心分离（15 000 r/min，20 min），获得上清液，放入100 mL容量瓶，用pH 3.0的甲醇定容[16]。将色素溶液进行适当稀释，在535 nm波长处测定吸光度值，根据标准曲线回归方程计算灵菌红素含量。

1.3.5 数据处理与分析

利用Excel 2019和Design Expert 8.0响应面软件进行统计分析及差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 K2HPO4浓度对发酵产灵菌红素的影响

K2HPO4浓度对粘质沙雷氏菌PG12生物合成灵菌红素的影响如图1所示，当K2HPO4浓度为20～30 mmol/L时，灵菌红素产量随K2HPO4浓度增大而显著增大；当K2HPO4浓度＞30 mmol/L时，灵菌红素产量反而下降。在菌体生长阶段，在一定浓度范围内适当提高磷酸盐浓度，可促进菌体生长，但随着磷酸盐被消耗，在次级代谢产物合成阶段的磷酸盐浓度通常要求不高于10 mmol/L[17-19]，否则会抑制次级代谢产物的合成。因此，根据接种量、发酵周期等具体情况，兼顾菌体生长和次级代谢对磷酸盐的需求，在高于10 mmol/L的范围内选择合适的磷酸盐浓度。在本试验条件下，灵菌红素产量在K2HPO4浓度为30 mmol/L时达到峰值1 446.4 mg/L。故选择最适K2HPO4浓度为30 mmol/L。

图1 K2HPO4浓度对菌株PG12产灵菌红素的影响Fig.1 Effect of K2HPO4 concentration on prodigiosin production by strain PG12

2.1.2 溶氧量对发酵产灵菌红素的影响

溶氧量对粘质沙雷氏菌PG12生物合成灵菌红素的影响如图2所示，溶氧量为15%～45%时，灵菌红素产量随溶氧量增大而增大；当溶氧量＞45%时，继续增大溶氧量，灵菌红素产量呈下降趋势。文献研究表明，灵菌红素发酵液保持较高溶氧量水平可促进粘质沙雷氏菌生长和灵菌红素合成[20]，发酵后期的耗氧量比发酵前期的耗氧量要小[21]。在本试验条件下，灵菌红素产量在溶氧量为45%时，达到峰值1549.1mg/L。故选择最适溶氧量为45%。

图2 溶氧量对菌株PG12产灵菌红素的影响Fig.2 Effect of dissolved oxygen on prodigiosin production by strain PG12

2.1.3 发酵时间对发酵产灵菌红素的影响

发酵时间对粘质沙雷氏菌PG12生物合成灵菌红素的影响如图3所示，在发酵时间18～30 h范围内，灵菌红素产量随发酵时间延长而增大；当发酵时间超过30 h，继续延长发酵时间，灵菌红素产量呈下降趋势。次级代谢产物的大量合成时间是在菌体停止生长之后，接种量、磷酸盐浓度等因素的大小往往导致最佳的发酵时间不同[16，22-24]。在本试验条件下，灵菌红素产量在发酵时间为30 h达到峰值1 577.6 mg/L。故选择最适发酵时间为30 h。

图3 发酵时间对菌株PG12产灵菌红素的影响Fig.3 Effect of fermentation time on prodigiosin production by strain PG12

2.2 响应面试验分析

2.2.1 回归模型的建立及方差分析

响应面试验结果见表2。根据相关文献方法，利用Design Expert 8.0软件对试验结果进行统计分析[25-26]，建立灵菌红素产量（Y）关于K2HPO4浓度（X1）、溶氧量（X2）和发酵时间（X3）的二次多项回归方程为：

表2 菌株PG12产灵菌红素发酵工艺条件优化Box-Behnken试验设计与结果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiments for fermentation conditions optimization for prodigiosin production by strain PG12

对该回归模型进行方差分析，结果见表3。由表3可知，回归模型的P＜0.000 1，表明回归模型极显著，而失拟项P为0.073 7，大于0.05，表明不显著，因而该模型成立。模型的决定系数R2和校正决定系数R2（Adj）分别为0.997 4和0.994 1，两者接近，说明模型的准确性较高。变异系数（coefficient of variation，CV）为2.37%，小于10%，表明试验具有较高的可信度和精确度，模型与试验拟合程度良好，可用该模型来预测灵菌红素的最佳发酵工艺条件。

表3 回归模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

续表

由P值可知，一次项X1、X2、交互项X1X2、二次项X12、X22、X32对灵菌红素产量有极显著影响（P＜0.01），一次项X3对灵菌红素产量有显著影响（P＜0.05）其他项对灵菌红素产量影响不显著（P＞0.05）。F值可知，各因素对灵菌红素产量的影响程度依次是：K2HPO4浓度（X1）＞溶氧量（X2）＞发酵时间（X3）。

2.2.2 响应曲面图分析

各因素交互作用对灵菌红素产量影响的响应曲面及等高线如图4所示，从3D的曲面图可以看出，K2HPO4浓度与溶氧量交互作用的曲面图坡度最陡峭，表明交互作用最强；而溶氧量与发酵时间交互作用的曲面图坡度最平缓，表明交互作用最弱。综合几个等高线分析来看，灵菌红素产量＜1 400 mg/L时，等高线较密；当灵菌红素产量≥1 400 mg/L时，对应的各因素数值大约集中表现为：K2HPO4浓度25.2～31.9 mmol/L，溶氧量＞33.5%。

图4 各因素间交互作用对灵菌红素产量影响的响应曲面及等高线Fig.4 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factors on the yield of prodigiosin

2.2.3 回归模型的验证

利用Design Expert 8.0软件求取二次曲面方程的极值，得到粘质沙雷氏菌PG12产灵菌红素的最佳发酵工艺条件为K2HPO4浓度28.45 mmol/L，溶氧量46.87%，发酵时间29.07 h，此条件下灵菌红素产量预测值为1 639.76 mg/L。考虑到实际操作的可行性，将优化的发酵工艺条件修正为K2HPO4浓度28.45 mmol/L，溶氧量47%，发酵时间29 h。在此发酵工艺条件下进行3次平行试验，灵菌红素产量实际值为（1 636.5±13.7）mg/L，与预测值接近，故该回归模型可用于优化粘质沙雷氏菌PG12的灵菌红素发酵条件。相对于原始条件（K2HPO4浓度30 mmol/L、溶氧量60%、发酵时间36 h）下的灵菌红素产量，优化条件下的灵菌红素产量提高了13.14%。

3 结论

通过单因素试验，筛选出K2HPO4浓度、溶氧量和发酵时间3种因素对灵菌红素发酵产量有较大影响。采用Box-Behnken响应面法确定最佳的发酵工艺条件为K2HPO4浓度28.45 mmol/L，溶氧量47%，发酵时间29 h。在优化条件下，灵菌红素产量达到1 636.5 mg/L，较原始条件下的灵菌红素产量提高了13.14%，表明响应面法优化工艺可行性良好，可以为灵菌红素发酵工艺条件控制的研究及生产实践提供参考。