基于网络药理学和分子对接探讨金银花、连翘药对治疗病毒性心肌炎的作用机制

杨 闯，马新宇，吴文胜

病毒性心肌炎(viral myocarditis，VMC)是由病毒感染导致的心肌局灶性或弥漫性病变，临床上病人症状差异明显，表现可从轻者的无症状到重者出现充血性心力衰竭甚至心源性猝死[1]。据统计，病毒性心肌炎的发病率为10/10万～22/10万[2]。2013年全球报告的心肌炎病例为150万例[3]。西医根据病毒性心肌炎的病因、病理、临床症状等，主要应用抗病毒治疗、免疫抑制治疗和免疫调节治疗3种治疗方法[4]。近年来，中医药在病毒性心肌炎的治疗上取得了一定进展[5]。

中医根据病毒性心肌炎的病因病机及临床表现等，可将该病归属于“温病”和由“温病”引起的“心悸”“胸痹”等范畴[6]。《黄帝内经》曾论述到：“复感于邪，内舍于心”，指出外感邪气可以引起心脏疾病。中医认为病毒性心肌炎多是由邪毒外侵，热毒入里，内侵于心而引起，临床上对于此类热毒侵心型病毒性心肌炎治疗多选用中药复方银翘散进行加减。李文等[7]临床观察证实银翘散可以改善急性病毒性心肌炎病人的中医证候、左心室收缩功能、室性期前收缩及调节心脏自主神经功能。田明明等[8]临床观察证实银翘散加减治疗小儿风热犯心型病毒性心肌炎临床疗效及心肌酶谱改善效果均明显高于对照组。银翘散出自清代著名温病医家吴鞠通的《温病条辨》一书，方中金银花、连翘共为君药，都具有辛凉解表、清热解毒的功效。现代药理学研究发现，金银花具有抗炎、抗氧化、抗紫外线损伤、降血脂、降血糖、抗病毒等作用[9]。连翘具有抗菌、抗病毒、抗炎、抗肿瘤、抗氧化等作用[10]。娄序笙等[11]的动物实验证明，金银花可明显抑制病毒性心肌炎小鼠核转录因子-κB(NF-κB)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3，CASP3)的表达。张益灵[12]的动物实验证明，贯叶连翘提取物可以缓解免疫性心肌炎小鼠心肌免疫损伤和减轻心肌炎症程度。尽管中药金银花、连翘被广泛应用于病毒性心肌炎的治疗中，但到目前为止，中药金银花、连翘治疗病毒性心肌炎的作用机制并不明确。本研究旨在通过网络药理学来寻找金银花、连翘药对治疗病毒性心肌炎的活性成分和作用靶点，并采用分子对接技术进行验证，来探讨金银花、连翘药对治疗病毒性心肌炎的潜在机制，为进一步研究提供依据。

1 资料与方法

1.1 金银花、连翘药物成分和药物靶点的获取与筛选 通过中药系统药理学分析平台(TCMSP，https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)数据库，查找金银花、连翘的有效成分及靶点，按照化合物口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%和类药性(drug likeness，DL)≥0.18为中药有效成分滤过条件[13]。利用perl软件整合金银花连翘有效成分及靶点。在UniProt数据库的UniProtKB功能(https：//www.uniprot.org/uniprot/)中筛选“Human”“Reviewed”基因库并下载，利用perl软件来过滤金银花、连翘潜在靶点。

1.2 药物作用疾病靶点的获取 以“viral myocarditis”为关键词在GeneCards(https：//www.genecards.org/)数据库、OMIM(https：//www.omim.org/)数据库、pharmGKB(https：//www.pharmgkb.org/)数据库获取病毒性心肌炎的疾病靶点，去重合并各数据库疾病靶点，并应用R软件安装Venn包来绘制Venn图。之后利用R软件筛选金银花-连翘与病毒性心肌炎的共同靶点，并绘制Venn图。

1.3 构建“药物成分-作用靶点”网络关系图 将获得的药物活性成分和作用靶点导入到Cytoscape 3.9.0软件中，使用Cytoscape 3.9.0软件构建“药物成分-作用靶点”网络关系图。

1.4 绘制蛋白互作(PPI)网络并筛选PPI网络核心靶点 将药物作用疾病的作用靶点导入STRING(https：//cn.string-db.org/)网站中，限制物种为“Homo Sapiens”绘制PPI网络。利用Cytoscape 3.9.0软件中的CytoNCA插件对PPI网络进行拓扑分析，并联合R软件找出每个条件大于中位值的基因。重复筛选，最终获得该网络的核心靶点，即为药物作用的关键靶点。

1.5 基因本体(GO)富集分析和京都基因和基因组百科全书(KEGG)富集分析 在R软件中安装BiocManager软件包，然后安装org.Hs.eg.db包，利用“org.Hs.eg.db”将药物作用疾病的作用靶点转换为entrezID。利用R软件的BiocManager软件包安装colorspace包、stringi包、ggplot2包、DOSE包、clusterProfiler包、enrichplot包，通过转换得到的entrezID，以Q<0.05、P<0.05进行GO富集分析并绘制柱状图。利用R软件安装pathview包，通过转换得到的entrezID，以Q<0.05，P<0.05进行KEGG富集分析并绘制柱状图及获取关键通路的通路图。

1.6 分子对接 将金银花、连翘治疗病毒性心肌炎的5个关键活性成分槲皮素(quercetin)、木犀草素(luteolin)、山奈酚(kaempferol)、汉黄芩素(wogonin)、β-胡萝卜素(beta-carotene)，通过PubChem(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库下载以上5个活性成分的分子结构，并使用Chem3D软件进行能量最小化处理，保存为mol2格式。在14个PPI网络关键靶点中，根据度值(Degree)的高低取前5个关键靶点进行分子对接。使用UniProt(https：//www.uniprot.org/)数据库对5个关键靶点进行检索，筛选条件为“Human”“Reviewed”。并在PDB(https：//www.rcsb.org/)数据库下载关键靶蛋白的PDB格式文件，依次为过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARG，PDB ID：1ZGY)、转录因子AP-1(JUN，PDB ID：6Y3V)、CASP3(PDB ID：1NME)、RAC-α丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶(AKT1，PDB ID：1H10)、细胞间黏附分子1(ICAM1，PDB ID：5MZA)。利用SYBYL-X 2.0软件进行分子对接并根据连接性能进行评分，从而推测药物活性成分与靶点蛋白的结合方式。

2 结 果

2.1 金银花、连翘药物成分和药物靶点的获取与筛选 药物有效成分经OB≥30%和DL≥0.18条件筛选后，从TCMSP数据库中查找到金银花靶点1 647个、有效成分23个，获得连翘靶点1 425个、有效成分23个。利用perl软件整合金银花、连翘有效成分及靶点后，将金银花、连翘活性成分对应的靶点与UniProt基因库相匹配，共过滤出214个药物靶点。

2.2 药物作用疾病靶点的获取 以“viral myocarditis”为关键词，在GeneCards数据库、pharmGKB数据库、OMIM数据库进行疾病靶点检索。其中GeneCards数据库检索结果以Relevance score>1进行过滤。将3个数据库检索结果整合去重后共获得疾病靶点747个，各数据库获取疾病靶点情况绘制Venn图(见图1)。通过R软件筛选到金银花-连翘与病毒性心肌炎共同靶点77个，并绘制Venn图(见图2)。

图1 数据库疾病靶点获取情况Venn图

图2 药物-疾病共同靶点Venn图

2.3 “药物成分-作用靶点”网络构建与分析 将金银花-连翘的药物活性成分和作用靶点导入Cytoscape 3.9.0软件中，绘制“药物成分-作用靶点”网络关系图(见图3)。该网络中共有101个节点、201条边、24个入血成分和77个靶点。根据入血成分的Degree值由高到低进行排序，选取前5个，依次为槲皮素(quercetin)、木犀草素(luteolin)、山奈酚(kaempferol)、汉黄芩素(wogonin)、β-胡萝卜素(beta-carotene)作为金银花、连翘药对治疗病毒性心肌炎的关键入血成分。

图3 “药物成分-作用靶点”网络关系图

2.4 绘制PPI网络并筛选PPI网络核心 在STRING网站绘制PPI网络关系图(见图4)。经两次Cytoscape 3.9.0软件的CytoNCA插件拓扑分析联合R软件的重复筛选后，最终获得14个核心靶点(见图5)，包括PPARG、JUN、CASP3、AKT1、ICAM1等， 即为金银花、连翘药对治疗病毒性心肌炎的关键靶点。

图4 PPI网络关系图

图5 核心靶点筛选

2.5 GO富集分析 将77条信号通路经R软件运行后进行GO富集分析，选取生物过程(BP)、细胞组分(CC)、分子功能(MF)3部分，共确定与病毒性心肌炎发生发展过程密切相关的条目2 355个。每个部分选取富集最显著的10个绘制GO富集条形图(见图6)。分别得到BP 2 193条，主要条目包括对脂多糖的反应(response to lipopolysaccharide)、对细菌来源分子的反应(response to molecule of bacterial origin)、细胞对化学应激的反应(cellular response to chemical stress)、对金属离子的反应(response to metal ion)、对氧化应激的反应(response to oxidative stress)、细胞对氧化应激的反应(cellular response to oxidative stress)等。得到CC 47条，主要条目包括薄膜阀(membrane raft)、膜微区(membrane microdomain)、膜区(membrane region)、小凹(caveola)、转录调节复合物(transcription regulator complex)等。得到MF 115条，主要条目包括DNA转录结合因子结合(DNA-binding transcription factor binding)、细胞因子受体结合(cytokine receptor binding)、磷酸酶结合(phosphatase binding)、蛋白磷酸酶结合(protein phosphatase binding)、细胞因子活性(cytokine activity)等。

图6 GO富集分析结果

2.6 KEGG富集分析 将77条信号通路经R语言运行后共富集到151条KEGG通路，选取富集最显著的前30个绘制条形图(见图7)。KEGG富集结果显示，金银花-连翘治疗病毒性心肌炎可能的作用通路主要富集在脂质与动脉粥样硬化通路(lipid and atherosclerosis)、糖尿病并发症中的衰老信号通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、流体剪切力与动脉粥样硬化通路(fluid shear stress and atherosclerosis)、白细胞介素-17(1L-17)信号通路(IL-17 signaling pathway)、肿瘤坏死因子信号通路(TNF signaling pathway)等信号通路。其中，脂质与动脉粥样硬化通路图见图8。

图7 KEGG富集分析结果

图8 脂质与动脉粥样硬化通路图

2.7 分子对接结果 使用SYBYL-X 2.0软件分别处理关键靶蛋白的PDB文件，删除水分子、添加氢键、提取配体分子并创建活性口袋，从而获得核心蛋白的可靠对接模型。将槲皮素、木犀草素、山奈酚、汉黄芩素、β-胡萝卜素 5个关键入血活性成分分别和核心靶点PPARG、JUN、CASP3、AKT1、ICAM1进行分子对接，并导出对活性成分-核心靶点连接性能进行评分的Total_Score表(见表1)，来判断活性成分-核心靶点的连接性能。选取与核心靶点连接性能Total_Score评分较高的活性成分，分别为PPARG-汉黄芩素、JUN-槲皮素、CASP3-槲皮素、AKT1-汉黄芩素、ICAM1-木犀草素构成对接图(见图9)。对接结果显示：关键活性成分与核心靶点能够通过氢键进行结合，可以形成稳定的空间结构。

表1 活性成分-核心靶点连接性能Total_Score 单位：分

图9 分子对接图

3 讨 论

金银花、连翘是我国历史悠久的中药材，《神农本草经》中记载：“金银花性寒味甘，具有清热解毒、凉血化瘀之功效，主治外感风热、瘟病初起、疮疡疔毒、红肿热痛、便脓血”。《神农本草经》中记载连翘“主寒热，鼠痿，瘰疬，痈肿恶疮，瘿瘤，结热”。现代研究表明，金银花具有解热、抗炎、抗病原微生物、增强免疫功能、抗机体毒素等药理作用[14]，金银花中的有效成分木犀草苷对心血管系统有着明显的保护作用[15-18]。连翘具有抗菌抗炎、抗病毒、保肝等药理作用[19]，连翘的有效成分异连翘酯苷、连翘酯苷都具有较强的抗氧化、抗菌能力[20]。因为金银花、连翘主要功效在于辛凉解表、清热解毒，所以常被用于温病初期和中期的治疗。病毒性心肌炎致病病毒多由肠道病毒(尤其是柯萨奇病毒)、腺病毒、细小病毒B19、人类疱疹病毒等导致[21]。病人发病之初多有体温升高、咳嗽、咽喉部不适等症状，病因、病机及症状表现与温病初期风热犯表证大致相同，因此，金银花、连翘常被用于病毒性心肌炎的治疗。尽管目前没有关于病毒性心肌炎与温病关系的系统论述，但许多医生对于病毒性心肌炎的诊疗在温病原则指导下，均取得了很好的临床疗效[22]。

本研究涉及了金银花-连翘的24个活性成分，根据入血成分的Degree值得到槲皮素、木犀草素、山奈酚、汉黄芩素、β-胡萝卜素等关键入血成分。其中，槲皮素、木犀草素、山奈酚、β-胡萝卜素为金银花-连翘两药共有成分。槲皮素、木犀草素、山奈酚、汉黄芩素是黄酮类化合物，黄酮类化合物已被证明对高血压、炎症、糖尿病和心血管疾病有效[23]。槲皮素可通过H9c2细胞中的信号转导因子、转录激活因子1以及丝裂原活化蛋白激酶途径来有效减轻肿瘤坏死因子-α(TNF-α)刺激的损伤，发挥在心肌炎中的保护作用[24]。木犀草素可通过抑制炎症来抑制柯萨奇病毒B3(CVB3)复制[25]。山奈酚可通过减轻血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)引起的炎症和氧化应激来防止AngⅡ引起的心脏重塑[26]。汉黄芩素可通过激活核因子E2相关因子2(Nrf2)介导的抗氧化反应来抑制心肌肥大[27]。低剂量的β-胡萝卜素可调节炎症，减少胱天蛋白酶信号，并与心肌细胞系中的自噬激活相关[28]。本研究涉及77个潜在药物作用靶点，GO富集分析发现金银花、连翘药对通过77个作用靶点参与病毒性心肌炎的多种生物学过程，KEGG分析得到脂质与动脉粥样硬化通路、糖尿病并发症中的衰老信号通路、流体剪切力与动脉粥样硬化通路等151条通路。筛选出PPARG、JUN、CASP3、AKT1、ICAM1等14个核心靶点。分子对接表明关键活性成分与核心靶点能够形成稳定的空间结构。其中ICAM1结合能力最强。有研究显示，ICAM1在CVB3引起的急性病毒性心肌炎小鼠的心肌细胞表达中起关键作用[29]。

综上所述，本研究利用网络药理学方法对金银花、连翘药对治疗病毒性心肌炎的有效成分、作用靶点及作用通路进行了研究，证明了中药金银花、连翘药对对病毒性心肌炎的治疗具有多成分-多靶点-多途径的特点，为今后深入探究金银花、连翘药对治疗病毒性心肌炎的作用机制提供了依据和参考。但是，本次研究没有考虑到中药活性成分的含量问题，同时只是选取了部分成分及靶点进行分子对接来验证，具有一定的局限性。