耐热克鲁维酵母在葡萄酒发酵中的研究和应用进展

唐 冲，成池芳，许引虎，段长青，燕国梁,*

（1.中国农业大学食品科学与营养工程学院葡萄与葡萄酒研究中心，农业农村部葡萄酒加工重点实验室，北京 100083；2.新疆中信国安葡萄酒业有限公司，新疆 昌吉 832200；3.湖北省酵母功能重点实验室，安琪酵母股份有限公司，湖北 宜昌 443003）

在葡萄酒发酵过程中，酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）负责将糖代谢成乙醇和CO2[1]，并产生多种风味物质，如高级醇、脂肪酸、脂肪酸酯等，实现快速、完全、高效的发酵[2]。实际上，在发酵过程中，还有其他多种不同酵母菌系（株）参与，包括非酿酒酵母（non-Saccharomyces cerevisiae）。非酿酒酵母是葡萄酒酿造中区别于酿酒酵母的一大类酵母的统称，主要包括假丝酵母属（Candida）、伊萨酵母属（Issatchenkia）、毕赤酵母属（Pichia）、有孢汉逊酵母属（Hanseniaspora）、德巴利酵母属（Debaryomyces）和克勒克酵母属（Kloeckera）等[3]。过去的研究中，非酿酒酵母往往被忽略或被认为是不受欢迎的腐败酵母菌，但随着研究的深入，人们发现其表现出与酿酒酵母迥异的代谢特性，例如能够分泌相关酶类从而改变和提升品种香气的比例和含量；高产脂肪酸类、高级醇、酯类和醛类物质；低产乙醇，能够改变酸的含量和比例。非酿酒酵母在葡萄酒发酵中的应用潜力越来越受到重视。在国外很多传统葡萄酒产区，酿酒师会综合考虑气候条件、葡萄品种、栽培条件，酿造工艺、卫生状况等因素，通过控制葡萄酒的发酵条件，充分利用非酿酒酵母的酿造优点，将其与酿酒酵母有机结合起来，酿造出风味复杂、独具特色的葡萄酒[4]。如将戴尔有孢圆酵母（Torulaspora delbrueckii）和酿酒酵母进行混合发酵，可以减少乙酸的产生，并且增加葡萄酒中的果香味[5]。星型假丝酵母（Candida stellata）与酿酒酵母混合发酵有助于减少乙酸、乙醛等不良气味的产生，提高葡萄酒酯类物质的含量[6]。东方伊萨酵母（Issatchenkia orientalis）发酵时可以产生较高浓度的酯类、高级醇、琥珀酸，与酿酒酵母混合发酵后可以降低挥发酸的含量，产生较多具有水果香气的酯类物质[7]。越来越多的研究结果也表明，本土非酿酒酵母菌株能够产生一些凸显产地葡萄酒独特感官特征的风味物质，从而赋予当地葡萄酒独特的品质和风格[8-12]。表1总结了部分常见的非酿酒酵母在葡萄酒发酵中的应用特点。

表1 部分非酿酒酵母菌的应用特点Table 1 Application characteristics of some non-Saccharomyces yeasts

在众多非酿酒酵母中，耐热克鲁维酵母（Lachancea thermotolerans，LT）是一种具有巨大应用潜力的酵母菌，它的主要酿造特性是能够在乙醇发酵过程中高产L-乳酸[24]，从而有效增加葡萄酒的酸度，具有生物“酸化剂”之称。高产乳酸的一个直接作用是能够降低pH值（降低0.3～0.5），对葡萄酒的色泽产生积极影响，有效提高葡萄酒的生物稳定性和颜色稳定性[13]。因此，LT高产乳酸的特性对于解决我国西部葡萄酒产区“糖高酸低”的产业问题具有重要的现实意义[25]。但与其他非酿酒酵母相比，目前对LT的研究报道还比较少。为此本文对LT在葡萄酒酿造中的研究和应用情况进行综述，以期对LT的进一步研究提供有益的参考和借鉴，加快其工业应用的进程。

1 耐热克鲁维酵母的基本性质

LT以前被称作Kluyveromyces thermotolerans，后来由Kurtzman[26]根据基因序列分析将其归为Lachancea属。LT基因组长度为10.6 Mb，含有8 条染色体[27]，图1是LT在WLN培养基上生长的菌落形态[28]和显微镜下的细胞形态[14]。

图1 LT在WLN培养基平板上的菌落形态（A）以及显微观察（B）[14,28]Fig.1 Colony morphology on WLN medium (A) and microscopic observation (B) of LT[14,28]

LT可以通过形成1～4 个球形子囊孢子进行有性生殖，也可以通过多端出芽方式进行无性生殖[15]。具有中等发酵活力，可耐受体积分数5%～9%的乙醇，也有研究发现在乙醇体积分数为9%时，LT可以存活数天[29]，表明LT对乙醇胁迫具有很强的菌株特异性。LT菌株可以耐受10～20 mg/L的游离SO2，有些菌株可以耐受100 mg/L的总SO2。研究表明，LT产H2S的能力为中高活性[30]。此外，LT对氧的需求要高于酿酒酵母，因此，氧气对于LT的存活和生长极为重要[31]。表2列出了LT的一些生理生化特性。

表2 LT的部分生理生化特性Table 2 Selected physiological and biochemical characteristics of LT

LT在自然发酵的葡萄酒中可以被分离得到，其不仅存在于葡萄果实中，还能从昆虫、植物、土壤等中分离出来[25]。LT的分离鉴定可以通过赖氨酸培养基以及CHROMagar®显色培养基进行（25～28 ℃的温度下培养），在CHROMagar®显色培养基中，酿酒酵母表现出紫色的菌落，而LT的菌落则为红棕色（其他非酿酒酵母多为乳白色），基于此性质，可以方便快捷地将LT分离出来[32]。之后再通过26S rRNA的D1/D2区域测序和/或随机扩增多态DNA指纹图谱来完成鉴定[33-34]。需要说明的是，与其他非酿酒酵母相比，LT在葡萄酒自然发酵中分离出的几率较低。

2 耐热克鲁维酵母对葡萄酒品质的影响

2.1 对主代谢产物的影响

乙醇是葡萄酒发酵过程中的主要代谢产物，在初始糖度为22%～24%的典型葡萄酒发酵过程中，约95%的糖会被转化为乙醇和CO2，1%转化为细胞物质，其余4%转化为其他产物，包括甘油、酸、高级醇、酯等[35]。Comitini等[36]研究发现，5 株不同的LT菌株发酵力（将糖发酵成乙醇的能力）从4.58%（乙醇体积分数，后同）到7.96%不等，而3 株酿酒酵母菌的发酵力范围为10.78%～12.62%，表明LT的发酵能力要弱于酿酒酵母，因此可以将LT与发酵能力强的酿酒酵母混合使用完成乙醇发酵[37-38]。同时根据LT低发酵能力的特性也可以将其单独接种进行低度酒的发酵，如啤酒发酵[39]和甜型酒发酵[40]，在这种情况下LT产生的乳酸可以与糖达到很好的平衡，增加酒体的新鲜感和平衡度。一些研究发现LT单独发酵也可以产生体积分数大于10%的乙醇（10.35%[41]或10.46%[42]），表明LT的发酵能力范围比较宽泛。Hranilovic等[43]比较了5 株不同的LT菌株与酿酒酵母在两种接种方式（同时接种和酿酒酵母延迟接种）下的发酵性能，发现乙醇发酵水平低于或与酿酒酵母单独发酵相当。需要指出的是，一些LT菌株与酿酒酵母在延迟接种时（先接入LT菌，培养一段时间后再接入酿酒酵母）最终的残糖含量较高，即引起了发酵迟滞现象，这主要是因为在接种酿酒酵母之前LT消耗了大量营养物质，使得酿酒酵母生长和发酵缓慢，因此二者的接种比例和接种时间需要重点关注。

甘油是仅次于乙醇的第二大酵母发酵产物，其含量是评价葡萄酒质量的重要指标之一，能够使酒液更黏稠，口感更甘甜[44]。Benito等[45]利用LT与酿酒酵母混合接种雷司令干白葡萄酒，发现甘油质量浓度比酿酒酵母单独发酵增加了0.29 g/L。这与Gobbi等[42]的研究结果一致，其发现混合发酵时甘油质量浓度增加了0.69 g/L，另外，低温发酵（20 ℃）比高温发酵（30 ℃）可产生更多的甘油，并且增加幅度随着LT接种比例的增加而上升。Shekhawat等[46]利用LT与酿酒酵母混合发酵霞多丽葡萄酒，以每天通入氧气的次数作为不同处理条件变量，发现甘油质量浓度随着通氧次数的增加而升高，最多可比对照升高0.19 g/L。综上，LT与酿酒酵母混合接种可以有效增加甘油含量，而温度和氧气是两个重要的影响因素。

乳酸是酵母发酵的另一种重要副产物，其口感柔和。它是由丙酮酸在酵母L(＋)和D(－)型乳酸脱氢酶催化下还原而生成。在葡萄酒发酵条件下，酿酒酵母主要合成D(－)型乳酸脱氢酶，形成200～300 mg/L的D-乳酸和极少量的L-乳酸。而LT生成的是L-乳酸，最高产量可以达到9.6 g/L。Kapsopoulou等[29]报道了从希腊北部产区分离出的一株LT（编号TH941），该菌在单一接种发酵时可以产生9.6 g/L乳酸，最终可滴定酸度比酿酒酵母高9.4 g/L，使得pH值从3.15降至2.90。该作者后续又进行了延迟发酵实验（先接种TH941，延迟3 d后接种酿酒酵母），发现总酸度比酿酒酵母对照组增加了5 g/L[47]，表明LT与酿酒酵母混合接种可以有效增加葡萄酒酸度。这种增酸作用对于低酸度葡萄酒的发酵非常重要，特别是温暖产区[48]，例如西班牙南部产区以及我国西北的新疆和宁夏产区。有研究发现，在温暖产区的红葡萄酒发酵中，LT产乳酸的水平要高于乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）在苹果酸-乳酸发酵中的合成水平[49]，这一现象在国内还有待进一步验证，因为葡萄品种和所接菌株对LT产酸率具有很大影响。需要指出的是，酿酒酵母会抑制LT的产酸效率[28]，因此若想达到较高的增酸效果，可以采用延迟接种酿酒酵母或适当增加LT接种比例的方式。

挥发酸是由微生物产生的腐败代谢产物之一，它会带来令人不快的酸味和辛辣味，对葡萄酒风味产生负面影响[37]。乙酸是葡萄酒中挥发酸的主要成分（约占挥发酸含量90%）[50]。Comitini等[36]比较了5 株LT菌株和3 株酿酒酵母菌株单独发酵时的挥发酸含量，发现酿酒酵母产生的挥发酸质量浓度比LT高50%左右，5 株LT菌的乙酸产量在0.32～0.58 g/L之间。杨婕等[51]在3 株LT（编号分别为LT1、LT2、LT3）分别接种4 d后接入酿酒酵母进行混合发酵，发现3 个实验组所产生的挥发酸质量浓度均显著低于酿酒酵母对照组（差异为0.08～0.15 g/L），证明LT具有降低挥发酸产量的能力。LT低产乙酸的特性可能与高产乳酸有关，即分流部分葡萄糖至乳酸降低了乙酸的合成。Vilela等[37]发现LT合成乙酸的能力与氧气浓度呈依赖性，这意味着为了降低乙酸浓度，要避免氧气接触或适当降低氧气浓度。

乙醛是酵母发酵的另一种副产物，少量的乙醛会给葡萄酒带来愉悦的香气，但当其含量过高时就会产生烂苹果等不良气味。与酿酒酵母相比，LT单独和混合发酵都能够降低乙醛含量。例如，Ciani等[52]发现LT单独发酵时乙醛质量浓度与酿酒酵母对照组相比降低了81 mg/L，LT与酿酒酵母同时接种和延迟接种时乙醛质量浓度与酿酒酵母单独接种相比分别下降了36 mg/L和63 mg/L，表明乙醛的下降幅度与LT单独存在的时间有关。Zenisova等[53]利用LT与酿酒酵母延迟接种白比诺葡萄酒时也发现了同样的现象。

2.2 对葡萄酒风味化合物的影响

高级醇和酯类化合物是葡萄酒中重要的香气物质[54]。与其他非酿酒酵母一样，LT与酿酒酵母混合发酵能改善香气轮廓与组成，但与其他非酿酒酵母相比，这种改善是有限的，例如德尔布有孢圆酵母（Torulaspora delbrueckii）。LT与酿酒酵母混合接种主要影响高级醇和乙醇酯的含量，并且与接种方式密切相关。在Balikci等[55]的研究中，LT与酿酒酵母顺序接种时2-甲基丁醇（23.94～25.47 mg/L）、3-甲基丁醇（94.22～97.37 mg/L）和异丁醇（28.43～33.04 mg/L）质量浓度与酿酒酵母单独发酵相比显著降低，而同时接种与对照没有显著差异。杨婕等[51]利用3 株LT（编号分别为LT1、LT2、LT3）分别与酿酒酵母进行顺序接种，发现酒样中高级醇总质量浓度（3 637.00～3 800.07 μg/L）与酿酒酵母对照酒样（4 316.77 μg/L）相比下降了12%～16%，但是某些高级醇，例如正丁醇、2,3-丁二醇、1-癸醇、苯乙醇含量要高于对照酒样。这与胡娟[56]的研究结果是一致的，其发现与对照相比，LT与酿酒酵母顺序接种时高级醇总含量减少了约25%。而Comitini等[36]在混合接种LT与酿酒酵母发酵时发现高级醇含量较酿酒酵母对照相比增加了约31%。

LT高产乳酸的性质会促进乳酸乙酯的合成，乳酸乙酯能够赋予葡萄酒水果香气以及奶油香气，对于葡萄酒香气具有积极的贡献[57]。不同的研究发现，LT与酿酒酵母混合发酵时乳酸乙酯与酿酒酵母对照组相比分别提高了3[36]、14 mg/L[48]和32 mg/L[58]。Shekhawat等[46]发现LT与酿酒酵母混合接种时乙酯总量相对于酿酒酵母单独发酵增加了约30%，其中增幅较大的是乳酸乙酯（33%）、丁酸乙酯（20%）、己酸乙酯（10%）和癸酸乙酯（10%）。

Korenika等[59]将LT与商业酿酒酵母BDX以顺序接种方式发酵土加克（Trnjak）、巴比奇（Babic）、布莱塔那（Blatina）、蓝佛朗克（Frankovka）4 种红葡萄酒，与BDX单独发酵相比，乳酸乙酯、乙酸异丁酯（甜香、果香）、香叶醇（花香）的含量都显著增加。另外，在白比诺葡萄酒发酵中，LT与酿酒酵母混合发酵增加了2-苯乙醇（花香）、琥珀酸二乙酯（果香）和乙酸苯乙酯（蜂蜜味）含量[53]。

2.3 对葡萄酒颜色的影响

颜色是评价葡萄酒质量的重要指标之一。红葡萄酒的主要呈色物质是花色苷，其组成和含量是决定葡萄酒颜色和稳定性的重要因素[60]。花色苷的组成和含量会受到辅色效应的影响。辅色效应是指花色苷与其他有机物或金属离子发生作用，形成呈色的辅色复合体，增加葡萄酒中呈色花色苷的比例可以影响葡萄酒的颜色[61]。pH值对花色苷的辅色效应具有重要影响，当葡萄酒的pH值在3左右时，辅色效应最强，随着pH值的升高，较多的花色苷会转变为无色的甲醇假碱，导致减色效应加剧[62]。Benito等[63]发现，LT与酿酒酵母混合发酵后酒样的颜色强度比酿酒酵母单独发酵增加了10%，这主要归结为其增酸效应降低了pH值，导致呈色花色苷比例增加，这种变化对于陈酿过程中保持酒体的色泽稳定性至关重要。Benito等[64]在后续研究中发现，与酿酒酵母相比，LT能够降低对花色苷的吸附作用，大幅增加葡萄酒中花色苷含量（飞燕草素葡萄糖苷含量增加25%，矢车菊素-3-O-葡萄糖苷含量增加50%，矮牵牛素-3-O-葡萄糖苷含量增加50%）。这些结果表明LT能够增强葡萄酒的颜色及稳定性，这种作用与其增酸降pH值和低花色苷吸附能力有关。

2.4 多糖和胞外酶产生情况

多糖是构成葡萄酒中大分子物质的主要成分之一，可以改善葡萄酒的酒体和口感，增强蛋白质和酒石酸的稳定性，同时还能够保护葡萄酒中的酚类物质，使其免受氧化[65]。Comitini等[36]比较了5 株LT菌株与3 株酿酒酵母单独发酵后的多糖含量，发现5 株LT菌株多糖质量浓度（163～260 mg/L）均高于酿酒酵母对照组（3 株酿酒酵母多糖质量浓度分别为132、128、152 mg/L）。Gobbi等[16]也发现LT无论是单独发酵还是混合发酵多糖质量浓度均高于酿酒酵母（增加30%～60%不等）。上述结果表明LT具有高产多糖的能力，会对葡萄酒的品质将产生积极贡献。

酵母菌除了合成不同的代谢产物外，还能够通过分泌各种酶来影响葡萄酒的感官和香气品质，胞外酶主要包括蛋白酶、果胶酶和糖苷酶[66]。Porter等[66]对111 株LT的产酶情况进行了研究，结果发现所研究的LT菌株中98%都不具有蛋白酶活性，只有12%的LT菌株具有β-糖苷酶活性。目前对于LT产果胶酶情况还鲜有报道。LT产糖苷酶和果胶酶能力可以作为筛选优良菌株的一个条件。

2.5 对苹果酸-乳酸发酵的影响

在乙醇发酵过程中使用LT会产生大量的乳酸（大于4 g/L），这对于后续的LAB启动苹果酸-乳酸发酵具有一定的抑制作用。但这种作用对于需要抑制苹果酸-乳酸发酵的情形是有利的，例如温暖产区的葡萄酒，可以避免大幅降酸以保持葡萄酒较高的酸度和生物稳定性，提升其感官品质，特别是新鲜型葡萄酒。而对于需要进行苹果酸-乳酸发酵的葡萄酒，可以利用将LT与LAB同时接种再延迟接种酿酒酵母的方式，在这种接种方式下，增酸作用来自于LT和LAB将一部分糖转化为乳酸。该混菌发酵技术已经用于1 t葡萄汁的发酵生产，最终产品pH值为3.3，而酿酒酵母对照产品的pH值为4[15]。需要注意的是这种接种方式要避免挥发酸含量的增加。粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）可以用于降解苹果酸，以取代LAB的苹果酸-乳酸发酵过程，但是粟酒裂殖酵母代谢苹果酸的终产物是乙醇，而苹果酸的大量降解会造成酸度过低的现象[20]。LT与粟酒裂殖酵母混合接种可以在一定程度上弥补该缺陷。

2.6 生物防治作用

赭曲霉毒素A（ochratoxins，OTA）是2A类致癌物，在葡萄酒中的含量有严格的规定[67]。Ponsone等[68]的研究表明，将LT菌株作为抗真菌剂喷施在葡萄上能够降低赭曲霉的生长，抑制OTA的积累，具体的抑制效果与OTA种类、LT菌株以及底物的水分活度和温度有关。Zeidan等[69]发现存活和灭活状态下的LT细胞对缓冲溶液中OTA的去除率高达71%和82%，这主要是因为LT菌株对OTA具有很强的吸附能力。因此，LT具有应用于果蔬产品OTA生物防控的潜能。

3 耐热克鲁维酵母高产乳酸的分子机制

乳酸的合成与乙醇、乙酸和乙醛合成密切相关，对LT高产乳酸的分子机制进行研究有助于有效、合理地调控其产酸能力，但目前相关研究还非常少[70]。Souciet等[71]首次对LT进行了全基因测序。在此基础上，Talla等[72]认为LT在糖代谢中是通过乳酸脱氢酶（LDH1、LDH2、LDH3）将丙酮酸转化为乳酸，而通过乙醇脱氢酶（ADH1、ADH2）将丙酮酸转化为乙醇（图2）。比较具有乳酸与乙醇合成差异的不同LT菌株的基因型可以揭示乳酸合成的分子机制[73]。Sgouros等[74]比较了3 株高产乳酸LT菌株（P-HO1、P-PT4和P-PHO8，乳酸产量分别为15.6、14.8 g/L和10.7 g/L）和两株低产乳酸的LT菌株（A1L7和P-PT5，乳酸产量分别为0.6 g/L和1.4 g/L）的基因型差异：在单独发酵条件下测定了3 种乳酸脱氢酶基因（LDH1、LDH2、LDH3）和2 种乙醇脱氢酶基因（ADH1、ADH2）的相对表达量，发现ADH1、ADH2、LDH1和LDH3在所有菌株中的表达量都没有明显的差异，只有LDH2基因在高产LAB株中高水平表达，而在低产乳酸的菌株中表达水平低，表明LDH2是调控LT菌株高产乳酸的关键基因。据此结果，有可能通过测定LDH2的表达水平来筛选高产乳酸的LT菌株。

图2 LT的发酵糖代谢简图[72]Fig.2 Simplified schematic representation of fermentative sugar metabolism in LT[72]

4 耐热克鲁维酵母与其他非酿酒酵母混合发酵对葡萄酒品质的影响

除了与酿酒酵母进行混合接种，LT还可以与其他非酿酒酵母进行混合接种（为了完成乙醇发酵，最终也接入酿酒酵母）改善或提升葡萄酒的相关品质，目前研究最多的是粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomces pombe）。粟酒裂殖酵母能够将苹果酸转化成乙醇[75]，已经被成功地应用于棕榈酒和朗姆酒的生产[76]。利用该特性可以降解葡萄酒中的苹果酸，以取代苹果酸-乳酸发酵（虽然会引起乙醇含量的升高）[77]。利用粟酒裂殖酵母降解苹果酸，可以避免LAB苹果酸-乳酸发酵产生的生物胺、氨甲酸乙酯和乙酸含量升高的问题，同时大幅缩短葡萄酒发酵时间[75,78]。但是会导致酸度大幅降低，通过混合接种LT与粟酒裂殖酵母可以在一定程度上弥补酸度的降低，解决该问题[63]。Benito等[48]发现与酿酒酵母单独发酵相比，LT与粟酒裂殖酵母混合发酵时葡萄酒中组胺浓度降低至原来的1/5，同时酸度和果香味增加。国内也有学者进行了相关研究，例如王玉华等[78]以甘肃武威产区美乐葡萄为原料，先接入3 株不同的LT菌（编号LTA、LTB、LTC），延迟4 d后接入粟酒裂殖酵母菌株。结果表明，与酿酒酵母单独发酵相比，混合发酵的挥发酸质量浓度降低0.11～0.16 g/L，总酸质量浓度增加0.96～1.97 g/L，某些香气物质（苯乙醇、萜烯类和大马酮）含量也得到提升，另外酒体颜色也发生了改变（色度增加、色调降低）。需要指出的是，以上研究结果都是基于巴氏杀菌的实验室规模实验，目前鲜见工业生产规模的数据。但可以肯定的是LT与粟酒裂殖酵母混合接种是一种很有潜力的接种工艺，可以满足消费者对葡萄酒多样化的需求以及降低生产成本。

除了粟酒裂殖酵母，Cristian等[79]尝试将LT分别与有孢汉逊酵母（Hanseniaspora vineae，HV）、德尔布有孢圆酵母（Torulaspora delbrueckii，TD）、美极梅奇酵母（Metschnikowia pulcherrima，MP）3 种非酿酒酵母进行混合接种，在发酵8 d后接入酿酒酵母（SC）进行三菌混合发酵。结果显示，在发酵前8 d，实验组的乙醇产量均远低于酿酒酵母对照组，总酸含量也较高；在接入酿酒酵母后，最终实验组的乙醇含量均低于对照组，增酸效果显著，但挥发酸含量低于对照组。其中LT和MP与酿酒酵母的组合效果最为显著，获得最低的乙醇含量（10.97%）和最高的总酸含量（4.73 g/L）。本课题组在前期研究中将LT9分别与德尔布有孢圆酵母（Torulaspora delbrueckii）TD12和葡萄园有孢汉逊酵母（Hanseniaspora vineae）HV6进行混合接种发酵，4 d后再接入酿酒酵母D254，结果表明，LT9参与的发酵乳酸含量都得到了提升，LT9与TD12混合接种乙酸含量最低，在香气方面，TD12＋LT9＋D254三菌混合发酵进一步提高了乙醇酯浓度，尤其是辛酸乙酯和癸酸乙酯，与D254对照组和TD12＋D254双菌发酵相比，其浓度分别提高了90.9%/31.9%和66.1%/29.9%[80]。HV6＋LT9＋D254三菌混合发酵实验组进一步提高了异丁醇和苯乙醇的含量，分别是D254对照组的1.46 倍和1.96 倍。以上结果表明，将LT与其他的非酿酒酵母菌株混合接种发酵可以弥补单一非酿酒酵母菌株的某些缺陷，产生增酸（总酸）、降醇、降低挥发酸和增香的效果，是一种提升葡萄酒品质和风味多样性的酿造方法。

5 耐热克鲁维酵母与酿酒酵母互作机制的研究

混合发酵过程中存在着不同属种、菌株之间的相互作用，这种相互作用显著影响着各个菌株的生长和代谢，改变了相关代谢产物的合成。研究发现，LT与酿酒酵母混合发酵过程中，高浓度的酿酒酵母会导致LT死亡[81]。有研究者认为这是由于酿酒酵母与LT接触后会分泌某些抗菌肽[82]，但是缺乏相关的实验数据支撑。Shekhawat等[83]利用RNA高通量测序技术对酿酒酵母与LT混合发酵时各自的基因表达进行了转录组学分析，结果表明：与单独发酵相比，混合发酵时两种酵母菌在转录水平上都发生了显著的变化。在酿酒酵母中主要有两类基因表达上调：与某些微量元素（如铜和铁）代谢有关的基因（FRE1、ENB1、FIT2、CTR3等）以及与细胞壁结构和完整性相关的基因（PAU5、PAU12、PAU17、PAU24等）。而在LT中，与细胞聚集、死亡以及应答渗透胁迫的基因（MIG2、OPY2、ERG3、ERG11、PHO11等）都显著上调。表明混菌发酵时酿酒酵母与LT做出的应答响应是不同的。酿酒酵母对LT造成环境胁迫，酿酒酵母为了更好地适应环境需要大量摄取甾醇、铜、铁等微量元素，并通过吸收更多的甘露糖蛋白来调节细胞壁组成，保持细胞壁和膜结构的完整性；而LT对环境的适应能力要弱于酿酒酵母，面对高乙醇、缺氧等环境胁迫会通过上调细胞聚集、消亡等相关基因来应答，表明混菌发酵中LT处于弱势地位。目前对于LT与酿酒酵母混合发酵中与葡萄酒品质直接相关的分子机制，如产香的分子机制还鲜见报道，这将是今后的研究重点。

6 耐热克鲁维酵母的商业发酵剂的开发与应用现状

在LT商业发酵菌剂的开发中，Concerto™是一个受到广泛关注的产品，它是由丹麦科汉森（Christian Hansen）公司开发和生产。根据该公司的产品宣传，Concerto™不仅可以增加酸度，还能够高产具有新鲜草莓香气的异丁酸乙酯，增加葡萄酒的果香，适用于温暖的葡萄酒产区[84]。同时该公司还推出了三元混合的商业发酵剂MelodyTM，包含酿酒酵母、德尔布有孢圆酵母（Torulaspora delbrueckii，TD）和LT，3 种酵母的比例分别为60%、20%和20%[85]。其目的是通过两种非酿酒酵母同时增加酸度和花果类香气，而通过酿酒酵母保证发酵顺利完成。

本课题组从辽宁冰酒产区自然发酵葡萄醪中筛选到一株LT（专利号ZL201910237439.9），该菌株具有很好的生理耐受性（包括耐受高糖、低温和乙醇胁迫），产乳酸能力强，而挥发酸产量低、絮凝性强、起酵能力突出，与酿酒酵母混合接种可以实现有效增酸，同时产生典型的葡萄柚、菠萝、芒果等水果类香气，目前该菌株已开发为商业发酵菌剂CVE-7，应用于新疆、甘肃、宁夏等葡萄酒企业，替代了传统的物理增酸工艺。该菌株的广泛使用有助于解决我国西部干热葡萄酒产区“糖高酸低”的产业问题。

7 结语

全球气候变暖使得世界各地所产葡萄“糖高酸低”的现象愈来愈普遍。LT高产乳酸的特性能够增加葡萄酒的酸度，提升葡萄酒的生物和颜色稳定性，这有助于新疆、宁夏等西部产区以及国外温暖种植区葡萄酒的生产加工。除了增酸，LT与不同酵母混合接种还可以改善和提高葡萄酒其他感官和风味特征，例如降低乙醇浓度、增加甘油和某些香气产物含量，具有非常好的应用前景。但是在应用时需要注意以下几点：1）酿造特性的菌株特异性：不同LT菌株的酿造和产香特性具有差异性，特别是产乳酸能力，因此，要根据生产目的进行预实验，对所选菌株的发酵和酿造性能进行评价；2）与其他菌株的适配性：特定LT菌株与不同酵母菌株（包括酿酒酵母与非酿酒酵母）混合接种时，其产酸和产香能力会受到其他菌株的影响，如果LT生长和对环境的耐受能力强，这种影响就小。接种方式（包括接种比例和接种顺序）也是影响混合发酵产酸和产香效果的重要因素，一般情况下，延迟接种方式的效果最好，因为可以在没有（接种）酿酒酵母“存在”下获得更高的LT浓度和更长时间的代谢活动，最大限度地“塑造”葡萄酒品质。但此时要避免出现增酸过度的现象；3）需要进一步增强LT的产香性能：LT在增酸（乳酸）方面的能力是毋庸置疑的，但是与其他非酿酒酵母相比，其总体产香能力不是十分突出，除了进一步筛选优良菌株外，优化多菌发酵工艺是一种有效的改进方式，特别是采用三菌接种工艺，即再引入一种产香能力突出的非酿酒酵母。除此之外，还需要在分子水平上对LT的产酸、产香机制以及在混合发酵中的酿造表型进行更加系统和深入的研究，阐明LT单菌和多菌发酵时的代谢特征，从而更好地控制和发挥LT的酿造优势，以适应不同区域、不同品种、不同风格和不同消费需求的葡萄酒生产。