生物芯片技术在生物医学研究中的应用进展

徐霁雪, 张博文, 魏鸾葶, 梁辰昊, 吴玉婷, 赵 艳, 李 成

(中国医科大学, 1. 第一临床学院, 2. 中英联合学院, 3. 临床二系,4. 免疫学教研室, 辽宁 沈阳, 110000)

生物芯片技术是通过微加工和微电子等微缩技术，依靠生物分子间的特异性相互作用，将生化分析集成于同一张芯片表面，建立一个微型的生化分析系统，从而实现对基因、蛋白质等生物分子准确、快速、高通量的检测[1-2]。尽管全世界范围内生物芯片产业技术仍处于成长阶段，但技术方法已日趋成熟，应用领域也在不断拓展，现将近年来不同类型生物芯片在生物医学研究中的应用现状综述如下。

1 生物芯片的发展

早在20世纪70年代, Edwin Southern就研究出了以其名字命名的Southern印迹技术，这被视为“生物芯片”在人类科学史上的首次亮相; 20世纪80年代初，“生物芯片”作为分子电子器件被首次提出; 20世纪90年代，随着人类基因组计划的出现和分子生物学的发展，以基因芯片为首的生物芯片技术应运而生，这使得进生物芯片技术入了全新的技术时代，也衍生出了如组织芯片、细胞芯片、蛋白质芯片等适用于不同研究目的的多种芯片技术类型[2-3]。目前，世界范围内参与研制生物芯片的公司已超过100家，其中有7家上市公司在中国，通过结合微刻技术及多种微流结构，生物芯片的种类倍增且具有反应迅速、易于调控与分析、通过集成多种实验步骤减少干扰等特点。值得一提的是，新型冠状病毒肺炎(COVID-19)的大流行使得生物芯片技术在医学研究以及快速诊断中的重要性被再次强调[4], 而生物芯片的量产与大规模应用势必会让其未来在生物医学领域中发挥越来越大的价值。

2 生物芯片的分类

生物芯片包含的种类很多，由于不同研究使用生物芯片技术的实验条件、实验方法、研究对象和研究目的有所不同，目前主要依据载体材料(硅芯片、玻璃芯片、陶瓷芯片、塑料芯片)、作用方式(主动式芯片、被动式芯片)、功能与用途(生物电子芯片、生物分析芯片)和芯片固定探针(基因芯片、蛋白质芯片、细胞芯片、组织芯片、糖芯片)进行分类[2, 5]。不同种类的芯片各有特点和优势，例如主动式芯片由于其快速、易操作的特点主要被应用于生物实验中对样品多步骤操作的集成简化，而被动式芯片则由于其高度平行的特点多被用于对大量生物信息的获取。本文依据芯片固定探针的不同对生物芯片进行分类，并综述各类型生物芯片在生物医学研究中的应用进展。

3 生物芯片的应用

3.1 基因芯片的应用

3.1.1 耐药菌检测: 基因芯片可在同一时间检测出多个基因表达的信息，可用于耐药菌检测，并为耐药菌相关疾病的诊断提供依据。FENG G等[6]使用基因芯片技术检测结核分枝杆菌的2种基因突变，即对利福平耐药的rpoB突变以及大多数对异烟肼耐药的katG基因或inhA启动子发生的突变，以确定结核杆菌对利福平和异烟肼的耐药性。该研究团队以药敏试验结果为参考标准，详细比较了4 148例来自不同级别抗酸杆菌阳性涂片的痰标本的检测效率，发现基因芯片技术的检测敏感性很高，可以直接用于临床标本耐药结核菌的检测。

3.1.2 遗传性疾病的产前诊断: 目前，基因芯片技术已经可以检测血友病、β-地中海贫血、先天性软骨发育不全、苯丙酮尿症等多种遗传性疾病，还可以实现对遗传病家谱的分析。2017年，加拿大妇产科医师学会、加拿大医学遗传学学会联合推荐利用染色体微阵列分析技术(CMA)进行产前诊断以及胎儿丢失评估。薛青霞等[7]对孕中期疑似高风险的1 129例孕妇进行羊水脱落细胞培养后，将基因芯片技术和染色体核型分析联合应用于产前出生缺陷筛查，发现相较于单独应用一项技术，联合应用可以显著提高检出率，有益于新生儿疾病的早期诊断和早期干预，为未来更高效且更精准地实施产前出生缺陷筛查提供强有力的技术保障。

3.1.3 肿瘤检测及抗肿瘤药物筛选: 基因芯片技术可对肿瘤发生与发展中相关的关键性基因进行检测，这在肿瘤的诊断、分型和抗肿瘤药物的筛选工作等方面发挥了重要作用。ZHOU L等[8]利用microRNA基因芯片对比分析肝细胞癌组织与正常组织中差异表达的微小RNA(miRNAs), 共鉴定出153个上调miRNAs和206个下调miRNAs, 并通过MCODE插件筛选基因、功能富集分析、蛋白质相互作用(PPI)网络构建发现FOXO1预计将受到所有20个miRNAs的调控，且证明miRNAs对于肝细胞癌的发生与发展具有重要意义，为研究肝细胞癌治疗新靶点提供了理论基础。

3.1.4 感染性疾病: 目前，基因芯片技术已被应用于病毒、细菌、寄生虫等致病基因表达、致病性和抗药机制的研究。黄姗等[9]应用Sanger测序法、荧光聚合酶链反应(PCR)和PCR-电化学基因芯片技术对宫颈脱落细胞进行人乳头瘤病毒核酸检测，发现基因芯片技术与传统方法具有良好的一致性，且具有特异性强、阳性检测值高等优势，为临床检测人乳头瘤病毒提供了新方法。在针对新型冠状病毒(SARS-CoV-2)感染病例的研究中，MCCORD J M等[10]应用基因芯片和转录组测序(RNA-seq)技术检测基因表达水平，发现在内毒素刺激的人肺动脉内皮细胞中编码细胞因子的36个基因中，红系衍生的核因子2相关因子(Nrf2)的活化成分PB125®对人肝源性HepG2细胞中ACE2和TMPRSS2mRNA有明显下调作用，进而抑制SARS-CoV-2激活进入宿主细胞。对重症COVID-19病例的观察结果显示，“细胞因子风暴”强度与病死率呈强相关，而Nrf2的激活或可有效抑制这些COVID-19相关炎性细胞因子的产生，进而显著降低“风暴”强度，这对于COVID-19的诊断与治疗具有重要意义。

3.2 蛋白质芯片的应用

目前，蛋白质芯片技术在医学检测方面应用广泛，例如确定抗原决定簇、鉴定蛋白功能、研究蛋白之间相互作用、蛋白磷酸化、药物分析、疾病诊断和体液检测等。

3.2.1 传染性疾病的快速筛查: 由于具有高通量、高特异性等优势，蛋白质芯片可用于传染性疾病的快速筛查和诊断。CHEN F等[11]利用聚乙二醇处理形成了一种特异性吸附表面，并在此基础上研发了疟疾表面等离子体共振蛋白质芯片检测技术，这种技术可对恶性疟疾的特异性抗体进行检测，具有无标记、即时、快速等优点，为进一步发展疟疾分型鉴定蛋白芯片技术奠定了基础，在疟疾环境易感人群的快速筛查方面具有重要意义。

3.2.2 代谢性疾病诊断: SUN G H等[12]利用细胞因子抗体芯片对10例急性痛风性关节炎(AGA)患者和10名健康人员血清样本中的蛋白质组学表达情况进行比较，发现AGA患者特征性表达蛋白如TNF-α受体Ⅱ(TNFRⅡ)、巨噬细胞炎性蛋白-1β(MIP-1β)、白细胞介素-8(IL-8)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)等均与健康人员有显著差异。研究人员进一步通过基因和基因组富集分析确定差异表达蛋白的生物学功能及信号通路，通过酶联免疫吸附试验(ELISA)方法验证60名AGA患者和60名健康受试者的差异表达蛋白，并通过受试者工作特征(ROC)曲线评价差异表达蛋白对AGA患者的诊断价值，最终确定AGA患者TNFRⅡ、MIP-1β、IL-8和GM-CSF这4种差异表达蛋白与AGA的发生发展密切相关，提示蛋白质芯片技术可通过检测AGA的生物标志物进行AGA风险预测与诊断。

3.2.3 癌症诊断: 大量研究证明，癌症患者血清中的自身抗体可用于癌症诊断，联合应用自身抗体可以提高癌症的诊断敏感性。SUN G Y等[13]制备基于食管鳞状细胞癌(ESCC)驱动基因的蛋白质芯片，最终有效识别出12种新型抗肿瘤相关抗原的自身抗体，其中GNA11、ACVR1B和P53这3个被认为是区分ESCC患者与健康人的重要标志，并可据此构建诊断ESCC的诊断模型。由此表明，蛋白质芯片技术可以有效识别新型抗肿瘤相关抗原的自身抗体，这对于探索癌症诊断新方法具有重要意义。

3.2.4 过敏反应检测: 既往过敏性疾病的检测多使用过敏原提取物，但由于来源材料和生产过程不一致，结果常有很大差异。目前，蛋白质芯片技术可对血清中的免疫球蛋白E(IgE)进行检测，同时筛选100多种可疑蛋白质过敏原，相较于先前的过敏原提取技术，其重要优势是能够区分真正的过敏反应和交叉反应，可有效提高过敏反应检测的准确性及效率[14]。

3.2.5 体液检测: 目前，蛋白质芯片体液检测技术已被用于确定嫌疑人并建立刑事案件。蛋白质体液检测芯片采用掠角沉积法制备长度为500 nm的银纳米棒-金属增强荧光传感器，并应用氨基功能化技术提高其结合能力，可以选择性识别精液和阴道液，且不存在交叉反应，准确率比市面上的快速染色鉴别精液试剂盒高10倍[15]。

3.2.6 信号分子检测: 蔡苏娜等[16]研究白杨素通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路发挥抗炎抗氧化作用的机制时，使用蛋白质芯片技术对发挥作用的信号分子进行筛选，并通过蛋白质印迹法进行验证，发现AKT/mTOR信号通路可被脂多糖激活，但又可被白杨素抑制。由此阐明，白杨素通过抑制上游活性氧(ROS)信号分子的合成，最终抑制相关促炎因子诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和环氧化酶-2(COX-2)的合成与释放，这为白杨素的临床应用以及其他抗炎药物的筛选提供了技术方法与理论基础。

3.3 组织芯片的应用

3.3.1 肿瘤研究: 为了更好地了解前列腺癌患者异质性结局的分子基础, OUELLET V等[17]根据检测目的和疾病状态的差异构建了3个独立的组织微阵列(TMA)集，即以淋巴结为主的检测前列腺癌生物标志物及淋巴结转移的TMA1、以雄激素剥夺治疗前后组织为主的检测前列腺癌对雄激素受体/雄激素轴抑制作用的反应的TMA2、用于评估致死性前列腺癌转移中不同解剖部位分子标记物异质性的TMA3。该资源现可作为前列腺癌生物标志物验证的工具，解决有关疾病进展和治疗反应的重要临床问题。

3.3.2 新药开发: REN L等[18]通过简单的光刻和激光切割构建高通量的心脏组织芯片，并结合微凹槽和电脉冲刺激，模拟心肌细胞电生理特性，再现了心肌细胞的良好排列结构和同步跳动，通过鉴定芯片上培养的心肌细胞的成熟情况和表型变化，可以评估各种药物治疗对心脏的毒性作用和保护效果。相较于动物模型和传统的细胞培养，这项技术更接近人体生理条件，为临床前药物开发提供了高通量的药物筛选平台。

3.3.3 罕见病样本收集与研究: LEE C J等[19]收集并使用软组织肉瘤患者的肿瘤材料构建TMA, 2015—2021年该团队已经构建了7个软组织肉瘤亚型的疾病特异性TMA, 还构建了1个覆盖了阵列中重要组织病理学亚型的多肉瘤TMA, 每个TMA块上都包含重复的几例某亚型的肿瘤组织，通过留存、使用并扩大这些包含肿瘤组织实体的芯片，可有效筛选肿瘤亚型，并为寻找药物靶点提供工具。由于肿瘤家族的异质性, TMA的种类也在逐渐扩大，可见组织芯片技术为罕见病的研究提供了更有效且具有成本效益的方式，同时也促进了不同课题组间的学术研究合作。

3.4 细胞芯片的应用

作为对基因芯片、蛋白质芯片的一种补充，细胞芯片是以活细胞作为研究对象，主要用于活细胞的培养以及活细胞中基因、蛋白质等生物组分的检测等。KIM G J等[20]应用计算机辅助设计并制作了一种工业聚乳酸材质的3D支架细胞芯片，该芯片可以促进细胞增殖和运动神经元分化。ABDULLA A等[21]建立了集成的微流控单细胞免疫印迹芯片，将对单个循环肿瘤细胞的分离、富集以及免疫印迹分析集成于同一系统，有助于提高丰度且减少其他细胞的干扰，基于此技术其成功地从顺铂处理的细胞中鉴定出一个传统批量分析无法检测到的细胞亚群——凋亡阴性(bax阴性)细胞亚群。LIU Y等[22]则基于微流控芯片开发了一种无凝胶的单细胞培养阵列用于培养结肠癌干细胞，大大提高了肿瘤球的成球率和肿瘤干细胞的培养效率, 1次培养大约获得13 600个细胞，可更有效地用于芯片外的细胞检测，这对于肿瘤生物学的研究和肿瘤干细胞特异性治疗策略的发展都具有巨大意义。

3.5 糖芯片的应用

目前，糖芯片主要通过检测糖分子与其他生物大分子的相互作用情况而分析不同种类糖分子的结构、功能与作用方式等。HOUEIX B等[23]通过糖芯片对人类共生副干酪乳杆菌的黏附素及其碳水化合物配体和包括人类在内的10种哺乳动物的胃肠道黏蛋白结合情况进行测定，为共生细菌在胃肠道的定植位点研究提供了依据。NANNO Y等[24]构建了一种包含超过400个糖缀合物的糖抗原芯片，检测5只食蟹猴移植成年猪胰岛后的免疫球蛋白M(IgM)和免疫球蛋白G(IgG)抗体特异性和相对浓度，为猪-猴胰岛异种移植后诱导抗体的碳水化合物表位分析提供了重要证据，并提示了未来胰岛异种移植中基因编辑的可能靶点。WAKAO M等[25]则利用表面等离子体共振生物传感器在黏蛋白O-聚糖糖链配体糖芯片上对凝集素进行分析，揭示了黏蛋白O-聚糖的核心3结构与植物凝集素Jacalin存在特异性相互作用。

4 展 望

从单纯地将生物组分集成以降低成本、提高效率，到实验步骤的集成，再到对组织、器官自然状态的模拟，生物芯片技术发展迅猛，且在医学生物研究领域中展现出了巨大的应用前景。近年来，随着微技术和芯片实验室(Lab-on-a-Chip)技术在生命科学领域中的发展，微流体与组织工程无缝融合，研究人员已开发出器官芯片(Organ-on-a-Chip)平台，即在生物芯片上模拟器官的生理活动及功能，这对疾病机制研究、药物研发和个体化用药方案制订均具有重大意义，同时也减少了实验动物的使用量[26]。目前，临床研究人员已经构建了几乎所有器官的单器官芯片模型[27], 后续的开发方向之一是将传感器集成到芯片中，从而实现更容易地检测关键性生理参数[28-29], 该领域的进一步发展可带来革命性的发现[26]。相关研究[30]指出，未来的器官芯片应该是多器官协同的和个体化的，例如可使用患者自身的细胞或活检组织在生物芯片上模拟疾病在患者体内的复杂变化。受到技术设备、操作、费用等因素的限制，目前生物芯片尚难以走出实验室，故开发操作简单、价格低廉的生物芯片是生物芯片得以广泛应用的前提，也是未来该领域重要的发展目标。