中性粒细胞在COVID-19发生发展中作用的研究进展

王 亮，司 萍，沈永明，崔晓鸣

天津市儿童医院/天津大学儿童医院 检验科，天津 300074

COVID-19是由SARS-CoV-2病毒引起，以发热、干咳、乏力为主要表现的呼吸系统传染病[1]。多数COVID-19患者预后较好，少数病例可短时间内快速进展并恶化。病毒感染机体的过程中，免疫(固有免疫和适应性免疫)应答启动，免疫细胞产生可溶性细胞因子或相应的T或B淋巴细胞发挥免疫效应进行机体防御。中性粒细胞是机体防御系统的第一道防线，被激活后可通过趋化、吞噬、脱颗粒作用以及形成一种特殊的网状结构-中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps，NETs)发挥功能。中性粒细胞还可以通过产生多种细胞因子和细胞表面分子与其他免疫细胞交互作用。但在严重炎性反应时中性粒细胞不可控地释放抗微生物物质或介导免疫抑制，在执行防御功能的同时也破坏了随后的机体免疫功能[2]。目前多项研究报道提示中性粒细胞以及NETs的生成与降解可能参与COVID-19的病理过程。现将COVID-19涉及的中性粒细胞以及NETs的相关研究进行综述，进而为COVID-19的防治提供新策略和新思路。

1 中性粒细胞数量

中性粒细胞是人类血液中含量最丰富的免疫细胞，是机体抵抗病原体感染的第一反应者，可通过释放黏附抗菌蛋白，蛋白水解酶以及活性氧杀灭病原体。并且其表面可表达多种趋化因子受体和补体受体，具有调节炎性反应，自身免疫和急性损伤修复等功能。中性粒细胞数量与COVID-19疾病严重程度密切相关。重症患者COVID-19患者淋巴细胞数量降低，中性粒细胞数量明显升高[3]。COVID-19病人在第12天病情恶化之前，中性粒细胞计数在第11天升高，而淋巴细胞和单核细胞数一直维持在较低水平[4]。并且年龄越大，中性粒细胞数量越多的COVID-19患者更易发生急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)，甚至死亡[5]。COVID-19患者肺组织中有广泛的中性粒细胞浸润[6]。并且中性粒细胞激活物(IL-8和G-CSF)和效应分子(抵抗素、中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白和肝细胞生长因子)是重症COVID-19患者的早期生物标志物，重症COVID-19患者中一些未成熟和/或功能失调的中性粒细胞可能与肺部免疫失衡相关[7]。众所周知，机体免疫调控是在多种免疫细胞的共同参与下完成，中性粒细胞作为非特异性免疫细胞可能在COVID-19疾病进展过程中发挥重要作用，特别对于COVID-19患者由轻症向重症以及危重症发展的影响值得进一步深入研究。临床工作中要特别注意中性粒细胞骤然升高的COVID-19患者，以免病情快速恶化。

2 中性粒细胞/淋巴细胞比值

中性粒细胞/淋巴细胞比值(neutrophil-to-lymphocyte ratio，NLR)是近来新发现的反映全身炎性状态的生物标志物，其与多种疾病的发生与预后密切相关，且简单易得而受到重视。NLR可以用来评估COVID-19患者的病情程度，有助于患者分级管理。相较于非ICU的COVID-19患者，入住ICU的患者淋巴细胞数量降低，而中性粒细胞数量以及NLR明显升高[8]。重症COVID-19患者NLR更高表明COVID-19预后不良[9]。而对于合并糖尿病的COVID-19患者其NLR水平与疾病严重程度以及住院时间呈正相关[10]。总之，NLR的监测可作为COVID-19进展的临床标志物，有助于早期筛查危重型患者。

大部分COVID-19患者淋巴细胞数量出现明显降低，其中包括CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞和B淋巴细胞。轻型COVID-19患者的肺泡灌洗液中发现大量CD8+T淋巴细胞，而在危重型COVID-19患者中，CD8+T淋巴细胞亚群、CD4+T淋巴细胞亚群消失[11]，提示疾病早期CD8+T淋巴细胞高度克隆扩增有助于病毒清除，出现轻度感染，但随着疾病进展加重，机体内适应性免疫应答受到严重破坏，导致机体抗病毒能力降低以及炎性反应。而严重炎性反应时中性粒细胞可以表达引起T细胞凋亡的表面蛋白而抑制适应性免疫反应，因此COVID-19病程中性粒细胞与T细胞之间的作用联系值得进一步研究。中性粒细胞/CD8+T淋巴细胞比值对于判断重型COVID-19患者预后以及疾病进展具有重要意义[12]。而中性粒细胞/CD4+T淋巴细胞比值与SARS-CoV-2的转阴时间有关[13]。中性粒细胞/CD4+T淋巴细胞比值升高表明机体免疫功能差，病毒清除时间延长。考虑到COVID-19重症患者中性粒细胞数量升高，淋巴细胞数量降低，故而NLR的差异性明显，但NLR是否可以作为COVID-19死亡率的独立预测因素仍需进一步研究。

3 中性粒细胞胞外诱捕网

NETs是由中性粒细胞受到刺激后产生的一种特殊的胞外网状结构，主要由DNA，组蛋白以及一些胞质蛋白分子构成，包括中性粒细胞弹性蛋白酶 (neutrophil elastase，NE)、髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)，组织蛋白酶G和其他一些抗菌蛋白。SARS-CoV-2能够直接诱导NETs释放，这种SARS-CoV-2诱导的NETs释放是肽酰基精氨酸脱亚胺酶4依赖的。并且COVID-19患者血浆NETs的浓度与病情严重程度呈正相关，而重症患者循环系统以及肺部感染浸润的中性粒细胞能够释放高浓度的NETs[14]。SARS-CoV-2感染的患者血浆中NETs明显增加，而有呼吸衰竭表现的患者NETs浓度更高[15]。COVID-19尸检的微血管血栓中发现部分退化性的中性粒细胞，而这些结构特点与NETs一致[16]。而在转录水平上证实了COVID-19患者中存在与NETs相关信号通路的激活，其中一些可能与NK和T细胞的负调节有关，从而抑制抗病毒反应[17]。NETs导致的血管阻塞不仅存在于COVID-19患者的肺组织，也存在于肾脏和肝脏，这意味着COVID-19患者，特别是重症患者，其器官功能障碍与过度的NETs形成和血管损伤有关[18]。以上研究结果说明NETs参与COVID-19进程，并发挥重要作用。

4 病理生理学机制

4.1 中性粒细胞募集

中性粒细胞的募集通常是趋化因子驱动。SARS-CoV-2感染的人肺上皮细胞以及COVID-19患者血清中存在CXCL2和CXCL8的高表达[19]，而COVID-19患者的支气管肺泡灌洗液(BALF)中也发现CCL2、CCL3、CCL4以及 CXCL10等细胞因子高表达[20]。在ICU的COVID-19患者其血浆中IL-2、IL-7、IL-10、CXCL10、G-CSF、CCL2、CCL3和TNF-α水平高于非ICU患者[21]。活化的肺泡巨噬细胞能释放TNF-α和IL-1β，从而使得肺泡中其他细胞产生趋化因子，进一步激活炎性级联反应，导致中性粒细胞不断迁移至肺部[22]。适度的细胞因子反应有助于病毒的清除，而细胞因子过量时会引起细胞因子风暴，而这些细胞因子能够招募更多的中性粒细胞集中到炎性灶，加剧炎性反应，导致明显的免疫病理损伤。

4.2 中性粒细胞相关产物异常增加

在COVID-19病理进程中，中性粒细胞相关的一些产物可能参与疾病的病理机制。COVID-19老年患者肺组织中抗氧化酶超氧化物歧化酶3的表达水平明显降低[23]，这反映了机体氧化应激程度加剧以及抗氧化失衡。活化的中性粒细通过“呼吸爆发”会释放大量的ROS，如氧自由基和H2O2，而过度的氧化应激可以导致COVID-19患者机体中细胞因子风暴，血栓的形成以及T细胞抑制[24-26]。因此，抗氧化治疗对于改善COVID-19患者T细胞的生存活性和功能，以及减少NETs的形成具有一定的疗效。DNA 是NETs的主要结构成分，用脱氧核糖核酸酶(DNase)处理，可以破坏NETs结构完整性。一些病原体通过表达DNase以降解DNA纤维网，进而逃避NETs的识别。SARS-CoV-2 脓毒症患者血浆中游离DNA水平升高，而DNase水平显著降低。通过对模拟SARS-CoV-2诱导的脓毒症小鼠模型外源性给药发现，重组长效DNase能够减少NETs的形成以及降低NF-κB激活和细胞因子水平，并且组织器官损伤标志物水平明显降低[27]。适当DNase可以保护机体免受体内释放的不适量NETs对自身组织的破坏作用，但其实际应用价值仍需进一步验证。NE是活化的中性粒细胞释放蛋白酶中的主要成分，也是NETs结构重要组成部分。对于表现为淋巴细胞减少症以及肺损伤评分<2.5的COVID-19患者早期应用NET抑制剂具有一定治疗效果[28]，但其安全性有待进一步探究。COVID-19血清中检测到高水平游离DNA、DNA-MPO复合物和瓜氨酸组蛋白H3(Cit-H3)，其浓度与疾病的严重程度具有相关性[15]，并且ARDS的发生与NETs形成增加有关[29]。这些与中性粒细胞相关密切的物质在COVID-19病理进程中可能发挥重要的促进作用，但对于这些物质来源是中性粒细胞发挥生理功能时的释放，还是伴随NETs的形成而产生尚未完全知晓，但抑制或者减少这些物质形成有望成为减缓COVID-19疾病进展的潜在治疗靶点。

4.3 NETs与补体

通过对COVID-19患者肺部尸检发现其具有独特的血管损伤特征，包括血管内皮炎性反应、血栓形成并伴有微血管病变。COVID-19患者血浆中NETs、组织因子(tissue factor,TF)活性和末端补体复合物(sC5b-9)的水平明显升高，并且患者的中性粒细胞产生高水平的TF，并形成携带活性TF的NETs[30]。NETs 含有高浓度的血栓源性TF可能是血栓形成的启动和持续必需条件。C3和C5抑制剂能够抑制COVID-19患者的高炎性反应状态[31]。通过阻断相应的补体途径，COVID-19患者表现出中性粒细胞计数，C-反应蛋白，IL-6和血清LDH水平的急剧下降，淋巴细胞明显升高以及NETs生成减少。对于COVID-19患者应用针对人补体C5a分子的单克隆抗体药物BDB-001注射液能特异性结合C5a，使C5a丧失结合受体的能力，从而抑制炎性级联反应[32]。这些结果提示补体和NETs参与机体不良的免疫反应，促进炎性反应和血栓性微血管病变，而针对补体-NETs-血栓轴为靶点的治疗策略将为COVID-19提供新的选择。

5 小结

中性粒细胞数以及NLR升高，不仅反映了COVID-19机体高炎性状态，同时也可以作为疾病进展的预警因子，临床工作中要加以重视。尽管关于中性粒细胞以及NETs在COVID-19致病机制中发挥的作用尚未完全阐明，并且多数研究处在早期研究阶段，但通过已有研究推断，或许对于COVID-19而言，中性粒细胞是把“双刃剑”，不仅发挥防御的作用，还可以阻碍其免疫功能，加剧炎性反应，特别是NETs，当其抑制机制失调或被过度激活时,它可能会介导疾病的病理过程，这也为COVID-19治疗方面的研究提供新的方向。目前仍然存在较多尚需解决的问题。通过进一步的研究，希冀了解中性粒细胞以及 NETs在COVID-19进程中的调控、功能和病理作用，最终实现在保持其免疫作用的前提下抑制其损伤属性从而应用于临床治疗。