线粒体功能障碍在肾结石成石中作用的研究进展

何綦琪，吴 晃,2，李昱卓，包军胜*

1.兰州大学第二医院 泌尿外科医学中心 兰州大学第二医院 泌尿外科研究所 甘肃省泌尿系统疾病研究重点实验室,甘肃 兰州 730030； 2.兰州大学 第二临床医学院，甘肃 兰州 730030

线粒体是机体产生能量的重要细胞器，其在不同组织细胞类型中的形状、大小和数量各不相同。线粒体是唯一具备双层膜结构及自身基因组的细胞器，主要功能是为细胞供能。除供能外，线粒体还参与细胞氧化应激、钙稳态、细胞凋亡和衰老的调节[1]。线粒体的功能障碍贯穿并影响各种代谢性疾病的发展，如糖尿病[2]、肥胖[3]、癌[4]、老化[5]、线粒体肌病[6]和神经退行性疾病[7]等。

近年来，有较多临床研究已明确了肾结石的发生与代谢综合征(metabolic syndromes，MS)、肥胖等代谢性疾病具有显著相关性，在糖脂代谢异常的条件下，结石成石更易发生且成石率更高，这可能与线粒体功能障碍直接或间接相关[8]。本文总结线粒体功能障碍与肾结石发生机制的相关文献，寻找通过改善线粒体功能来预防肾结石发生的潜在证据，以期对后续肾结石的基础研究及预防性药物设计提供新思路。

1 线粒体在人体肾细胞中的功能简述

在人体内，肾实质细胞中的线粒体数量仅次于心肌细胞。大量线粒体细胞器可提供足够的能量来维持体内酸碱及电解质平衡、血液过滤、营养再吸收和血压调控[9]。尤其在近端肾小管上皮细胞，其线粒体密度远高于肾内其他细胞，集合管内的暗细胞也是富含线粒体的细胞，在酸碱平衡和钠、氯、钾转运调节中发挥重要作用。

1.1 供能作用

线粒体主要是通过生产腺苷三磷酸 (adenosine triphosphate，ATP)来进行细胞供能的，ATP分子的产生一方面源于氧化磷酸化过程中电子呼吸链及线粒体内膜间的电子转移，另一方面，三羧酸循环也起着关键作用。在肾脏中，肾小管细胞需要较多的能量来介导皮质内的主动转运功能，而肾小球细胞只需要少量能量维持过滤和被动转运过程[10]，因此肾小管中存在较高密度的线粒体，肾结石的产生源于肾小管，其结石成分中也存在线粒体蛋白。

1.2 氧化应激的调节

大量证据表明肾结石的产生与组织氧化应激相关。氧化应激主要是由于过多自由基(free radical)的产生和线粒体活性氧(reactive oxygen species, ROS)过量释放引起的，其中复合物Ⅰ和Ⅲ的电子转移过程会生成过量的ROS。在正常生理条件下，线粒体本身具有高效的抗氧化系统，如超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)及谷胱甘肽过氧化物酶(glutathi-one, GSH)等；一旦ROS的产生远超过抗氧化系统的调节范围，线粒体则难以清除过多产生的ROS，进而会损伤线粒体，造成线粒体DNA(mitochondrial DNA, mtDNA)损伤及线粒体蛋白的氧化修饰[11]。因此，线粒体的抗氧化系统对于维持供能和保护线粒体功能具有重要作用。尤其是谷胱甘肽氧化还原循环，该机制对细胞内急性产生的ROS起到关键的缓冲作用，是防止氧化应激损伤和保护线粒体功能的最主要环节。此外，核转录因子2(nuclear transcription factor 2, NRF2)在氧化应激条件下也能够上调抗氧化物酶基因表达，从而对抗过多的ROS产生，对维持细胞内稳态及线粒体功能保护具有重要作用[9]。目前已明确在肾结石生成过程中会产生较多的ROS且结石石核中含有较多的破碎的线粒体蛋白，提示线粒体可能直接参与结石的生成。改善线粒体抗氧化应激功能可能对于肾结石发生具有重要意义。

1.3 凋亡的调控

线粒体同时参与细胞程序性凋亡或死亡调控[12]。凋亡细胞死亡机制主要有两条途径，即线粒体参与的内在途径和程序性死亡相关受体参与的外在途径。半胱天冬蛋白酶(caspases)的激活是两种途径进行的共同最终环节。在内在途径中，线粒体细胞色素C被释放至胞质中，与凋亡蛋白酶激活因子1(apoptotic protease activating factor-1, APAF-1)和ATP结合，促使procaspase-9形成凋亡小体，将procaspase-3转化为效应caspase-3，导致细胞凋亡。而在外在途径中，细胞外配体与程序性死亡相关受体结合，诱导程序性死亡信号复合体的形成，caspase-8可以直接刺激效应caspase-3，导致细胞凋亡。线粒体功能障碍会致细胞凋亡过程中组织炎性反应加剧，其主要通过丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)、核因子κB(NFκB)等炎性通路损伤组织。在肾结石的产生过程中，组织炎性反应也是肾结石石核形成的重要原因之一。

2 肾结石疾病中线粒体功能作用的相关研究

较多的基础及临床研究证实了氧化应激及炎性反应是参与肾结石形成的重要因素[13-14]。氧化应激反应的同时也会诱导下游的级联效应，尤其是组织炎性反应和炎性损伤的产生，从而趋化组织中的黏附因子，增加成石晶体尤其是草酸钙结晶(CaOx)在肾小管或肾间质内的滞留。在肾结石病早期，肾小管上皮细胞产生过量的ROS诱发细胞损伤，与此同时，线粒体激活抗氧化物系统应对这种氧化应激损伤，减少细胞组织损伤，并抑制肾结石的形成[15-16]。因此，线粒体直接参与细胞氧化应激反应，其功能稳定性对肾结石的发生发展具有重要作用。

钙离子是尿液中最常见的离子之一，易与其他阴离子特别是草酸盐和磷酸盐结合以晶体形式沉淀。在所有不同类型的肾结晶成分分析中，草酸钙结晶(calcium oxalate crystal, CaOx)为最常见的一种。在正常生理条件下，CaOx晶体产生后黏附在肾小管细胞的表面，然后通过胞吞作用内化到细胞内，随后在胞内通过降解或溶解进行排泄，其最终产物是游离钙离子和草酸盐离子。如果出现长期的钙超载，会导致线粒体的功能障碍，进而ROS过量产生，黏附因子趋化及胞吞作用能力减弱，使得胞内相关降解排泄过程减弱。此外，过量的ROS还会导致mtDNA损伤，继而引起线粒体裂变和融合过程的改变、细胞损伤、凋亡、炎性反应，形成恶性循环，进一步导致疾病进展。经电镜观察，肾结石患者的肾小管细胞出现肿胀，线粒体内存在钙致密沉积；也有其他一些研究表明线粒体能够与草酸盐和CaOx晶体结合，其结合机制主要是通过线粒体蛋白和脂质过氧化作用介导，从而进一步促进了CaOx晶体的形成和聚集[17]。有研究在结石基质中发现了线粒体蛋白，在肾远端管腔结石晶体中也发现了线粒体碎片，证明了线粒体可能参与肾结石早期形成。

虽然已经发现线粒体与草酸离子和CaOx晶体的形成与消除具有直接作用，但既往的研究只集中于它们在调节氧化应激和组织损伤方面的作用，也有几项关于肾结石的线粒体损伤、ROS过度产生、线粒体膜电位丧失和线粒体肿胀的疾病机制[9,18]。对于线粒体功能检测及其调控的对照研究相对较少；MS大鼠模型较正常大鼠更易产生肾结晶，经动态研究观察发现MS大鼠抗氧化水平低，更易出现高草酸尿，而尿钙水平却较正常组降低；是否存在线粒体碎片黏附游离钙或钙致密沉积导致尿钙减少还有待进一步明确；此外，线粒体谷胱甘肽(mitochondrial glutathione, mGSH)可以保护线粒体功能，减少高草酸尿状态下的草酸沉积[19]。相反条件下，mGSH减少则可能会引起线粒体功能的损失，并可能导致CaOx肾结石的发生，但目前仍缺乏有效证据。线粒体功能障碍不仅与肾小管损伤有关，而且可以通过降低CaOx结石部位单核细胞的线粒体功能，导致细胞的晶体清除能力下降，从而进一步加剧组织炎性反应，导致免疫反应和组织受损，刺激诱发Randall斑块的形成，最终导致肾结石的发生。目前没有线粒体功能调控肾结石相关的直接临床证据，仅有部分动物研究针对已受损的免疫反应和组织炎性反应、间质斑块的形成使用各种抗氧化剂或自由基清除剂及多糖化合物，可以有效预防肾结石形成[20-21]。

3 线粒体功能障碍参与肾结石病的病理生理机制

草酸和钙均可改变线粒体的结构，促使线粒体稳态改变，导致线粒体能量生产、ROS调节和细胞内钙稳态功能不同程度的受损。目前的基础研究大致通过3个潜在机制来体现线粒体功能障碍的病理生理与肾结石成石机制的相关性。

1)胞内晶体黏附[21]：过量的草酸及游离钙离子早期会诱发肾细胞内产生过量的ROS，清除大量的ROS会促使线粒体功能下降、供能减弱，导致线粒体ROS清除能力的进一步下降，抗氧化酶产出减少。此外，过量的ROS、细胞色素C、游离钙离子和其他促炎相关因子进一步释放到胞质中，进而通过诱导脂质过氧化损伤细胞膜，促进肾细胞顶端的晶体沉积。再者，细胞色素C激活的凋亡信号级联反应促进肾小管细胞损伤，诱发黏附因子表达，导致胞膜顶端的晶体穿破胞膜并不断扩大聚集，最终脱落随尿液流动至肾乳头开口处泌出，形成肾结石石核。

2)胞外聚集成石[22]：线粒体功能障碍导致细胞碎片释放聚集形成结石核心；细胞色素C的释放诱导细胞凋亡。随后，凋亡小体、细胞碎片和破碎的亚细胞器被释放到管腔中，然后与草酸盐和CaOx晶体结合再进行迁移。这些线粒体及亚细胞器成分、膜碎片等细胞碎片可直接作为远端肾段结石病灶形成的原料，进一步促进晶体相互黏附、生长、聚集。大的聚集物可能阻塞管腔或迁移(通过肾小管液体流动)到肾盏内形成结石。

3)间质成石机制[23]：线粒体功能障碍引发Randall斑形成；在氧化应激条件下，线粒体损伤可导致线粒体膜完整性的破坏，随后向细胞质释放ROS、mtDNA、ATP和线粒体碎片。这些碎片成分可以诱导促炎细胞因子的分泌并触发炎性因子级联反应，同时也可招募各种免疫细胞，包括组织巨噬细胞等趋化至此间质区域。这些免疫细胞的迁移可诱发组织炎性反应。肾间质通常情况下处于富磷酸钙过饱和状态。伴随组织炎性反应及相关因子的不断趋化作用下，富含磷酸钙的Randall斑形成。其中一些斑块增长后侵入肾盏乳头或肾盂(大部分位于肾乳头内外侧)，促进肾结石的进一步发展。

就上述3种研究潜在机制而言，ROS的大量释放均为导致肾细胞线粒体功能丧失的原因，其线粒体抗氧化能力下降导致组织炎性改变，两者共同作用导致草酸及钙调紊乱诱发石核产生。

4 问题与展望

线粒体在肾结石病理生理过程中起重要作用，其作用机制主要通过调节氧化应激和胞内钙稳态诱导肾组织损伤和炎性反应，促进结石晶体形成、生长、聚集和沉积。值得注意的是，线粒体功能障碍本身并不足以诱发肾结石的形成，例如mtDNA突变或有缺陷的编码线粒体蛋白会导致几种线粒体功能不全相关疾病：如阿尔茨海默病、癫痫、线粒体肌病、脑病、乳酸酸中毒和卒中样发作(MELAS综合征)等。然而，目前尚未有相关证据表明这些线粒体疾病和肾结石疾病之间存在关联。肾结石的形成则涉及多种肾内微环境改变[24-25]，如CaOx或磷酸盐的过饱和、ROS过量释放、肾小管细胞损伤、氧化应激反应及串联的炎性级联反应、尿量减少等诸多因素；其中钙超载及CaOx/磷酸盐的过饱和应为其始动因素，线粒体相关的氧化应激反应及炎性级联反应为其中间途径，石核形成后聚集释放则为疾病发展的最终结果。在明确了上述致病机制后，通过抗氧化剂调节线粒体功能可能是预防新发或复发性肾结石形成的有效途径。

抗氧化药物可用于保护线粒体活性并拮抗各种疾病中ROS的过量产生，但其临床疗效和不良反应仍不明确。有基础研究表明只有CaOx结晶才会导致线粒体功能受损，而单纯草酸盐则不会[24]。此外，核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NOD-like receptor protein 3，NLRP3)炎性小体在多种代谢性疾病中被认为是衔接ROS与炎性反应的中间靶点，其表达下调后也可以逆转潜在的线粒体损伤，减少胞内ROS的过量释放及肾小管细胞损伤；调控亲环素(cyclophilin D, Cyp D) 和B细胞淋巴瘤-2 相互作用蛋白3 (BNIP3) 能通过修复线粒体功能来减少机体的氧化应激损伤[9]。目前尚未见肾结石治疗中的相关线粒体保护/修复剂疗效的临床报道，还有待进一步探索研究。

迄今，关于线粒体功能障碍、胞内或线粒体内钙分布与结石发病机制之间的研究仍少见。从结石形成机制的相关性而言，此领域相关研究必将开启肾结石形成机制的新认知、新视角，并在未来为肾结石预防策略提供新理念。