基于QuECh ERS的GCQQQ同时检测肉制品中的有机磷农药残留量的研究

张碧宇，周建峰，项林敏，颜艳阳，隋玉杰

（1.温州市质量技术检测科学研究院，浙江 温州 325000；2.温州市食品药品检验科学研究院，浙江 温州 325000）

我国是世界上肉制品生产和消费第一大国。随着生活水平的提高，肉类食品在居民食品消费中的比例日益增加，人们对肉制品的安全问题也越来越重视。同时，肉制品中的农药残留问题也逐渐引起人们的关注。肉制品中常见的农药残留主要有有机磷农药残留、有机氯农药残留和拟除虫菊酯农药残留等。目前，残留最多的种类是有机磷农药[1]。一方面，有机磷农药在农业生产中的广泛使用，导致农作物中存在不同程度的农药残留，并对土壤和水体环境造成一定程度的污染，由此导致畜禽饲料及生活环境的有机磷农药污染。其中，倍硫磷更是对水生生物具有极高毒性，可能对水体环境产生长期不良影响，澳大利亚自2015年10月以后禁止使用含有倍硫磷的产品；另一方面，在畜牧养殖加工过程中，二嗪磷、辛硫磷、倍硫磷等作为兽药杀虫剂广泛用于畜类防疫杀虫方面，可按比例配制成药液，喷涂牲畜体表或进行药浴。其中，二嗪磷可注射牛体，灭杀牛瘤蝇的幼虫，也可作为家庭卫生用杀虫喷雾剂。

此外，在我国，因农药残留引起的食品中毒事件时有发生，不法商家在腌制火腿等食品中，添加有机磷农药用来防腐和防虫[2]，更有甚者，用有机磷农药浸泡肉制品来牟取非法利益。有机磷农药超标会导致人体出现一系列神经中毒症状，如出汗、震颤、精神错乱、语言失常，严重者会出现呼吸麻痹，甚至死亡[3]。

由此可见，二嗪磷、辛硫磷、倍硫磷不仅可以作为农药杀虫剂，还可作为兽药杀虫剂，从而导致肉制品中有机磷农药残留超标，通过生物链富集到人体，进而产生残留毒性，严重威胁人体健康。但在国内标准中并无肉制品中有机磷残留量的检测方法[4]，国内外文献报道中也未见肉制品中有机磷残留量的GC-MS/MS检测方法。目前，对于肉制品中有机磷的前处理方法主要有液液萃取法[5]、固相萃取法和GPC净化法等[6-7]。这些方法在处理样品的过程中，有机试剂使用量大，导致洗脱、浓缩过程耗时、费力、污染大。而基于QuEChERS法的前处理方法具有试剂使用量少、前处理过程简单、回收率高等优点[8]，不仅有利于实验室提高检测效率，还能减少有机试剂的污染。有机磷的检测方法主要有光谱法[9-10]、气相色谱法[11-13]、气相色谱-质谱联用法[14-16]、液相色谱-三重四极杆联用法[17-19]。但是，气相色谱法仅能依靠时间定性，在结果判断中易出现把杂峰误认为目标峰的情况，从而导致判断错误，影响检测结果；气相色谱-质谱联用法也同样有类似的问题，时间相近的且离子碎片质量相同的情况下无法准确定性；液相色谱-三重四极杆联用法虽然准确性比前两者高，但它不能检测有机氯农药，存在一定局限性。而GC-MS/MS检测方法，不仅检出限低、干扰少，能够同时检测多种类农药残留，且以多反应监测进行判断，提高结果的准确性。试验通过对QuECh-ERS前处理方法的优化，并采用高灵敏度和准确度的GC-MS/MS检测肉制品中二嗪磷、辛硫磷、倍硫磷、倍硫磷砜、倍硫磷亚砜残留量。这不仅能确保肉制品的质量，达到有效监管，维护消费者的权益；还能为今后肉制品中有机磷国家标准的制定提供数据基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

不同种类的市售肉制品样品，包括酱油肉、卤羊排、酱牛肉、卤鸡腿、烤鸭、烧鹅、卤猪心、酱鸭舌、卤猪肝、卤牛百叶、卤鸭肠（依次编号为1～11），市售；乙腈、乙酸乙酯、C18粉、硫酸镁、氯化钠、柠檬酸钠、柠檬酸氢二钠、PSA，上海安谱实验科技股份有限公司提供；二嗪磷、辛硫磷、倍硫磷、倍硫磷砜、倍硫磷亚砜、环氧七氯B标准品（质量浓度100 mg/L），上海安谱实验科技股份有限公司提供。

1.2 仪器与设备

8890A-7000D型气相色谱-三重四极杆质谱联用仪（配有电子轰击源EI）、HP-5型色谱柱（30 m×250μm×0.25μm，美国Agilent公司产品；T25型分散机，德国IKA公司产品；水浴加热氮吹仪，上海安谱实验科技股份有限公司产品；SIGMA 3K15型冷冻离心机（转速≥5 000 r/min），美国Sigma公司产品；涡旋混合仪，赛默飞世尔LP Vprtex Mixer公司产品；移液器（Research Plus），美国Eppendorf公司产品；微孔滤膜（0.22μm有机相），上海安谱实验科技股份有限公司产品。

1.3 方法

1.3.1 标准溶液配制

分别准确移取5种有机磷标准品1.00～10 mL棕色容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度，配制成10.0 mg/L的混合标准溶液，在-18℃下避光保存。称取5 mg环氧七氯B标准品至10 mL棕色容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度，配制成500.0 mg/L标准储备液，在-18℃下避光保存。移取环氧七氯B标准储备液1.0～100 mL容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度，配制成5.0 mg/L的标准工作溶液。在进行测试前，移取适量有机磷混合标准溶液和环氧七氯B标准工作溶液，配制成标准工作曲线。制作标准工作曲线质量浓度为10.0，20.0，50.0，100.0，500.0 ng/mL，内标质量浓度为100.0 ng/mL。

1.3.2 样品的制备

（1）样品制备。将样品1～11分别用粉碎机粉碎、装袋、标号，密封后保存于-18℃冰箱中。

（2）加标样品制备。取2.00 g粉碎后的样品1室温解冻，按照0.05，0.10，0.50 mg/kg这3个水平的加标量，将稀释后的有机磷混合标准溶液加入到肉制品中，加入乙酸乙酯溶液5.0 mL，在室温下自动振荡12 h，待混合均匀后，氮吹挥去多余溶剂，即获得加标样品，与冰箱4℃下保存，备用。前处理优化及部分方法学数据以样品1为代表进行检测，而实际样品分析是将样品2～11号按照2.3.2加标制备所得。

1.3.3 样品前处理[20-21]

称取2.0 g样品（精确至0.01 g）于50 mL塑料离心管中，加入乙腈10 mL、硫酸镁4 g、氯化钠1 g、柠檬酸钠1 g、柠檬酸氢二钠0.5 g，匀浆1 min后以转速8 000 r/min离心5 min。吸取上清液6 mL加到硫酸镁1 200 mg、PSA 400 mg及C18400 mg的15 mL塑料离心管中，涡旋混匀1 min，以转速8 000 r/min离心5 min，准确吸取上清液2 mL于10 mL试管中，40℃水浴中氮气吹至近干。加入内标溶液20μL，加入乙酸乙酯1 mL复溶，过微孔滤膜，用于测定。

1.3.4 GC-MS/MS参数

色谱柱：Agilent HP-5 Ultra Inert（30 m×250μm×0.25μm）；程序升温（70℃保持2 min，然后以25℃/min升温至150℃，再以5℃/min升温至240℃，12℃/min升温至300℃，保持6 min）；载气：He（纯度≥99.999%），流速1.2 mL/mim；进样口温度280℃；进样量1μL；进样方式：不分流进样；电子轰击源70 eV；离子源温度280℃；MSD传输线温度280℃；溶剂延迟3 min；多反应监测：各目标物分别选取一对定量离子、一对定性离子。

定量离子、定性离子其保留时间、定量离子对、定性离子对和碰撞电压见表1。

表1 定量离子、定性离子其保留时间、定量离子对、定性离子对和碰撞电压

1.3.5 前处理优化试验

（1）萃取溶剂的选择。准确称取2.0 g样品于50 mL塑料离心管中，分别以乙腈、甲醇、丙酮进行萃取，其他条件不变，按1.3.3处理，考查回收率，确定最佳的萃取试剂。

（2）粉剂比例的优化。准确称取2.0 g样品于50 mL塑料离心管中，其他条件不变，按1.3.3处理，在匀浆前，改变粉剂加入量，分别加入硫酸镁4 g、氯化钠1 g、柠檬酸钠1 g、柠檬酸氢二钠0.5 g（下称“粉剂Ⅰ”）；C18粉2.0 g（下称“粉剂Ⅱ”）；硫酸镁4 g、氯化钠1 g、柠檬酸钠1 g、柠檬酸氢二钠0.5 g、C18粉2.0 g（下称“粉剂Ⅲ”）进行考查，确定最优粉剂加入比例。

（3）水浴温度的优化。准确称取2.0 g样品于50 mL塑料离心管中，其他条件不变，分别以40，50，60℃下水浴温度进行氮吹，考查回收率，确定氮吹时最佳的水浴温度。

2 结果与分析

2.1 前处理优化结果

2.1.1 萃取溶剂的选择及结果

不同萃取试剂及加标回收率见图1。

由图1可知，不同的萃取试剂对这5种农药的加标回收率影响不大，但由于丙酮会萃取较多杂质，且价格较甲醇和乙腈高，不利于实验室开展大批量试验计划；而乙腈的极性比甲醇大，更适用于萃取大部分农药。因此，选取乙腈作为萃取溶剂。

图1 不同萃取试剂及加标回收率

2.1.2 粉剂比例的优化及结果

不同粉剂比例及加标回收率见图2。

图2 不同粉剂比例及加标回收率

由图2可知，随着C18粉的增加，辛硫磷的回收率显著下降，而倍硫磷亚砜在粉剂Ⅲ中回收率最高，综合5种有机磷农药的回收率数据，选择粉剂Ⅰ为最优粉剂比例，能满足农药残留检测的要求。

2.1.3 水浴温度的优化及结果

不同水浴温度及加标回收率见图3。

图3 不同水浴温度及加标回收率

由图3可知，40℃水浴温度下，加标回收率略优于其他温度，因此选择40℃作为水溶温度。

2.2 方法学评价

2.2.1 线性关系、线性范围、相关系数和检出限

取1.3.1配制的标准工作液1.0 mL加入5个氮气吹干的空白样品中，按照1.3.4设置的气相色谱仪和三重四极杆质谱参数，分别进样标准曲线工作液。以目标物响应值于内标物响应值的比值为纵坐标、目标物浓度为横坐标绘制标准曲线，得到5种农药的标准曲线。分别以3倍和10倍信噪比计算检出限和定量限。

5种农药的线性关系、线性范围、相关系数、检出限和定量限见表2。

表2 5种农药的线性关系、线性范围、相关系数、检出限和定量限

2.2.2 精密度、回收率

采用上述建立的方法，以1.3.2制备的样品1进行试验，在0.05，0.10，0.50 mg/kg这3个水平分别做6个平行试验，将样品连续进样3 d，得到日内和日间精密度。

日内和日间精密度见表3。

表3 日内和日间精密度

结果表明，5种农药在样品1中的日内和日间回收率均为86%～120%，相对标准偏差为1.0%～11.7%，符合农残检测的要求。

2.2.3 稳定性试验

将2.2.2处理的样品分别在第1天、第3天、第7天分别进样，以回收率判断样品的稳定性。

稳定性试验回收率见表4。

表4 稳定性试验回收率

结果表明，样品在7 d内保持稳定。

2.2.4 实际样品加标分析

按照1.3.2制备2～11号样品，加标量为0.10 mg/kg，按照2.2.2处理，每个样品重复2次，并分别做空白试验。

实际样品回收率见表5。

表5 实际样品回收率

结果表明，样品回收率在80%～120%，符合农残检测的要求。

3 结论

建立了以QuEChERS法为基础的GCQQQ同时检测肉制品中5种农药残留的方法。该方法具有前处理简便、准确度高、检出限低、重复性好、稳定性佳等优点，适用于肉制品种农药残留量的定性和定量分析，能为今后肉制品中农药残留检测提供依据。