铁死亡在急性肾损伤中的研究进展

许新杰 葛勤敏

急性肾损伤(acute kidney injury,AKI)是一种肾功能的突然受损,伴有血肌酐水平增高和尿量减少,持续时间多在7 d内,其发生在10%～15%的住院患者和50%的危重患者中,发病率和死亡率较高[1]。研究[2]结果表明,AKI增加了住院患者患CKD和心血管疾病的潜在风险,极大地加重了社会负担和患者的经济负担,因此早预防、早发现AKI至关重要。AKI的发病机制复杂,动物和细胞实验均表明铁死亡(ferroptosis)在AKI的发病中发挥着重要作用[3]。本文就铁死亡发生时的细胞特征和调控机制,以及其在各种AKI类型中的研究进展进行综述。

1 铁死亡

1.1 细胞特征 铁死亡是一种铁依赖的非凋亡性细胞死亡,主要伴有膜脂质过氧化产物的积累和质膜多不饱和脂肪酸的消耗。与其他形式的调节性细胞死亡(如细胞凋亡和细胞焦亡)相比,铁死亡具有独特的形态学特征和生物化学表现[4]。在形态学方面,铁死亡主要表现为线粒体的改变,包括体积减小、膜密度增加、线粒体嵴减少、外膜破裂,但细胞核保持正常,无染色质凝集[5]。然而,线粒体损伤是否在铁死亡中起促进作用,还是仅代表其不可逆转的发生结果,存在争议。在生物化学方面,铁死亡表现为过量的亚铁离子(Fe2+)通过芬顿反应催化过氧化氢(H2O2),产生有毒的羟基自由基,从而引发细胞脂质过氧化。同时,随着细胞内谷胱甘肽的消耗和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GPX)4的失活,细胞内脂质过氧化物不断堆积,进一步加重了细胞损伤[6]。除了谷胱甘肽和GPX4,还可以通过测定组织或细胞裂解液中Fe2+、4-羟基壬烯醛和丙二醛水平以更加全面地评估细胞内铁相关脂质过氧化的程度[7]。值得注意的是,铁死亡与细胞凋亡和氧化应激反应重叠,仅使用铁死亡的生物标志物来判断铁死亡的发生或许是有争议的,因此将铁死亡的细胞形态学与生物化学变化结合,综合判断会更加准确、可靠。

1.2 调控机制

1.2.1 GPX4 GPX4是GPX家族成员中重要的铁死亡调控因子,而谷胱甘肽是一种由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸合成的细胞内必需抗氧化剂,其可以广泛参与细胞内的抗氧化反应,并能使H2O2水平维持在一定的生理范围内[8]。谷胱甘肽的耗尽会导致GPX4失活,GPX4的功能活性依赖于谷胱甘肽的生物合成[9]。具体来说,GPX4在将还原型谷胱甘肽转化为氧化型谷胱甘肽的同时,可以将具有细胞毒性的脂质过氧化物还原为相应的醇,从而减轻细胞氧化损伤[6]。因此,当GPX4水平下降时可促进细胞的铁死亡,反之,铁死亡将被抑制。已有研究[10]证实,GPX4抑制剂RSL3作为一种铁死亡激动剂,通过使GPX4失活诱导细胞发生铁死亡。

1.2.2 胱氨酸/谷氨酸反向转运体 胱氨酸/谷氨酸反向转运体是哺乳动物细胞膜上表达的众多氨基酸转运蛋白之一,其核心活性亚基是重组溶质载体家族7成员11(recombinant solute carrier family 7 member 11,SLC7A11),胱氨酸和谷氨酸可以通过胱氨酸/谷氨酸反向转运体以相同的数量进入和排出细胞。胱氨酸进入细胞后会增加谷胱甘肽的合成,从而激活GPX4,维持细胞内氧化还原动态平衡,因此通过抑制胱氨酸/谷氨酸反向转运体可使细胞内谷胱甘肽水平迅速降低并增加细胞对铁死亡的敏感性[11]。此外,有研究[12]报道,通过直接上调细胞中SLC7A11的表达抑制铁死亡可以治疗疾病,所以SLC7A11也被认为是铁死亡的生物标志物之一。

1.2.3 铁代谢与氧化应激 细胞的铁代谢稳态与铁的吸收、储存、循环和利用密切相关。人体吸收的大多数膳食铁以铁离子(Fe3+)的形式存在,需要被十二指肠细胞色素b还原为Fe2+的形式才能被吸收。铁蛋白是由2个亚基(重链和轻链)组成的蛋白质复合体,负责铁的储存,因此被认为是最重要的内源性铁螯合剂[13]。在铁与血浆中的转铁蛋白结合之前,需要被氧化成Fe3+的形式,然后通过膜蛋白上的转铁蛋白受体1以内体形式进入细胞,之后被铁还原酶再次还原为Fe2+[14]。其中少量的Fe2+用于维持正常生理条件下的新陈代谢,但过量的Fe2+则会通过芬顿反应触发铁死亡,因此铁在体内的吸收和利用受到多种铁代谢相关蛋白的严格调控。核转录因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)是调节细胞内氧化应激反应的关键转录因子,对维持细胞内氧化还原的动态平衡有重要影响。当细胞受到过量活性氧的刺激时,Nrf2表达上调以激活一系列下游的抗氧化物酶而减轻细胞氧化损伤,这其中就包括GPX4和血红素加氧酶1(heme oxygenase 1,HO-1)[15]。研究[16]显示,HO-1水平升高伴随着铁蛋白重链的表达,如上所述,铁蛋白重链作为内源性铁螯合剂可以将Fe2+转化为Fe3+,从而防止脂质氧化,这表明Nrf2具有重要的抗铁死亡作用,可能是铁死亡的重要调节因子,铁代谢、氧化应激和铁死亡之间存在密切联系,寻找三者之间的平衡关系或将有助于减轻铁依赖的氧化损伤。

2 铁死亡与AKI

2.1 缺血再灌注损伤引起的AKI 在缺血再灌注损伤引发的AKI中,细胞凋亡一直被认为是细胞死亡的主要机制,但使用细胞凋亡相关抑制剂无法有效地阻断AKI的发生[17],而使用铁死亡抑制剂脂血抑素1(liproxstatin 1)能够减轻缺血再灌注引起的组织损伤,明显保护了肾功能[18]。泛连接蛋白1(pannexin 1)是一种ATP释放途径家族蛋白,研究[19]发现沉默泛连接蛋白1可促进细胞内抗氧化酶HO-1的表达,并通过丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶途径抑制铁死亡,减轻肾脏的缺血再灌注损伤。鸢尾素是一种运动诱发激素,可改善线粒体功能并减少活性氧的产生。研究[20]发现,使用鸢尾素治疗可以显著减轻小鼠肾脏缺血再灌注损伤的炎症反应、内质网应激和氧化应激,其作用机制可能与促进GPX4表达上调有关。槲皮素是一种天然黄酮类化合物,具有抗氧化、抗炎和抗衰老等药理学作用。研究[21]发现,槲皮素可通过下调激活转录因子3基因的表达,显著增高SLC7A11和GPX4的表达来抑制肾小管上皮细胞的铁死亡。这一结论在关于微RNA(microRNA,miR)对缺血再灌注诱导大鼠肾损伤的调节作用的研究[22]中也得到了验证,缺血再灌注诱导miR-182-5p和miR-378a-3p上调,并通过下调GPX4和SLC7A11导致了肾损伤中铁死亡的激活。因此,铁死亡可能是缺血再灌注损伤引发AKI的主要途径。

2.2 顺铂引起的AKI 顺铂是应用广泛的抗肿瘤药物,其主要的不良反应是严重肾毒性[23]。长期以来,为了更好地应用这一治疗药物,研究者们一直在尝试阐明顺铂诱导肾毒性的发生机制。GPX4在顺铂诱导的AKI中显著下调,而铁死亡生物标志物4-羟基壬烯醛和丙二醛上调,表明铁死亡在顺铂诱导的AKI中发挥着重要作用[24]。维生素D受体激动剂帕立骨化醇可以通过减少脂质过氧化并逆转GPX4下调,防止顺铂诱导的AKI[25];这与马钱素治疗顺铂诱导AKI的机制相似[24]。与之相反,近端肾小管中肌醇加氧酶的过度表达可以加重顺铂处理后小鼠肾脏的铁死亡损伤[26]。大脑中富含的Ras同源物1(Ras homolog enriched in brain 1,Rheb1)作为一种三磷酸鸟苷酶,在调节细胞生长、分化和存活等方面起着至关重要的作用。研究[27]发现,Rheb1可以通过维持线粒体稳态防止顺铂诱导的肾小管细胞铁死亡。富马酸二甲酯是一种口服的小分子药物,研究[28]发现其能通过Nrf2的抗氧化作用来预防铁死亡并改善AKI。还有研究[29]发现,铁蛋白重链基因敲除小鼠注射顺铂后的肾损伤较对照组小鼠更严重,表明铁蛋白重链作为体内重要的铁代谢相关蛋白,其对肾小管损伤具有重要的保护作用。以上研究结果也表明,使用铁螯合剂去铁胺或铁抑素-1(ferrostatin-1)可以明显减轻顺铂引起的AKI[26,29]。

2.3 叶酸引起的AKI 叶酸诱导的AKI模型被认为是模拟人类AKI的理想模型。研究[30]发现,在使用铁死亡抑制剂铁抑素-1预处理的小鼠中,叶酸诱导的细胞内脂质过氧化和组织损伤明显减轻,肾功能得以改善。FG-4592是一种缺氧诱导因子-脯氨酰羟化酶抑制剂,研究[31]发现,FG-4592预处理可以升高细胞内谷胱甘肽水平并减少铁离子的积累,其保护机制主要是通过激活细胞内的抗氧化酶Nrf2,从而抑制了叶酸诱导的肾脏细胞铁死亡,延缓了纤维化进展。研究[32]发现,核受体亚家族1组D成员1(nuclear receptor subfamily 1,group D,member 1;NR1D1)可以通过直接结合ROR反应元件抑制SLC7A11和HO-1的转录来促进铁死亡,因此靶向抑制NR1D1可以限制铁死亡,改善小鼠叶酸诱导的AKI。从荷叶中分离出来的主要生物活性化合物荷叶碱(nuciferine)可以通过提高细胞内谷胱甘肽和GPX4水平来阻止叶酸诱导的AKI的铁积累和脂质过氧化,从而抑制铁死亡[33]。上述研究结果表明,铁死亡在叶酸诱导的AKI中起着重要作用。

2.4 横纹肌溶解症引起的AKI 横纹肌溶解症的原因包括外伤、药物、毒素和感染等,AKI是横纹肌溶解症的严重并发症。研究[34]结果表明,肌红蛋白代谢产生的Fe2+直接诱导近端肾小管上皮细胞脂质过氧化可能是横纹肌溶解症导致AKI的重要发病机制。Guerrero-Hue等[35]的研究发现,姜黄素作为一种强大的抗氧化剂可以抑制肾脏细胞的铁死亡,其机制可能是通过抑制Toll样受体4/NF-κB信号通路和激活细胞内的HO-1减轻了肌红蛋白介导的炎症和氧化应激反应;该研究还发现使用铁抑素-1可以明显改善注射甘油小鼠的肾功能。

2.5 其他AKI模型 马兜铃内酰胺Ⅰ是马兜铃酸的重要代谢产物,有一定的肾毒性,研究发现其可以显著降低细胞内谷胱甘肽的水平,同时伴随4-羟基壬烯醛和Fe2+表达的显著上调。铁螯合剂甲磺酸去铁胺和铁死亡抑制剂铁抑素-1可以明显减轻马兜铃内酰胺Ⅰ诱导的细胞毒性,而Nrf2/HO-1/GPX4抗氧化信号通路可能是预防含马兜铃内酰胺Ⅰ的药物诱导的AKI的重要干预靶点[36]。α-硫辛酸是一种具有清除自由基和螯合有毒金属能力的天然抗氧化剂,研究[37]发现其可有效减轻人体金属植入物钴引起的肾脏铁死亡。上述研究结果表明,铁死亡广泛参与各种AKI类型的发生、发展机制。

3 靶向铁死亡治疗AKI

鉴于铁死亡广泛参与各种AKI类型的发生、发展机制,靶向铁死亡发生通路可能是预防和治疗AKI的新策略,主要包括铁螯合剂疗法、靶向铁代谢相关蛋白、亲脂性抗氧化剂和铁死亡的直接抑制剂[38]。铁螯合剂疗法的总体策略是减少不稳定铁池,最大限度地减少活性氧的产生,从而防止铁负荷过高引起的脂质过氧化。除了铁螯合剂外,细胞内铁的耗竭也可以通过靶向铁代谢相关蛋白实现,研究发现增加血液循环中的铁调素(hepcidin)可以诱导膜铁转运蛋白1的降解并促进铁蛋白的表达,可以有效恢复铁稳态和减少活性氧的生成[13]。细胞内Nrf2过度激活不仅可以促使其下游一系列抗氧化酶产生,还可以增高谷胱甘肽的水平,有效遏制了肾脏缺血再灌注损伤进展的早期阶段[39]。HO-1作为一种细胞内抗氧化保护酶,在缺血再灌注、顺铂和脂多糖诱导的多种动物损伤模型中都起到了很好的AKI预防作用[40]。以铁抑素-1为代表的铁死亡抑制剂主要通过干扰脂质过氧化来抑制铁死亡[41],但在体内的使用受限于其稳定性和有效性较低。因此,临床上急需开发出一种更加安全、稳定,可被用于治疗人类疾病的铁死亡抑制剂。

4 总结和展望

铁死亡是一种铁依赖的以脂质过氧化为特征的调节性细胞坏死,与细胞凋亡和细胞焦亡等调节性细胞死亡形式相比,铁死亡具有独特的形态学特征和生物化学表现。除了脓毒症AKI,铁死亡与其他各种形式AKI的发生关系密切。因此,以铁死亡为靶点进行深入研究可能为AKI治疗提供了一种全新的方向。考虑到AKI的复杂性,一种发病机制的干预可能不足以获得治疗成功,AKI患者可能会受益于多种细胞死亡抑制剂的联合治疗,这也需要研究人员采取更加多维的视角来开展研究。