生物炭对三七连作土壤性质及真菌群落的影响

孙海航 官会林 王旭 王童 李泓霖 彭文洁 刘柏桢 樊芳玲

（云南师范大学能源与环境科学学院，昆明 650500）

三七（Panax notoginseng）是五加科植物，又称文三七、田七，是我国传统的名贵中药材，在我国中医药行业中，已经成为仅次于人参的中药材大品种，具有重要的经济价值［1-2］。三七具有化瘀止血、消炎镇痛的功效，在跌打损伤、冠心病、心绞痛、脑血管后遗症、高血压等疾病的治疗中得到广泛应用［3］，是云南白药、复方丹参滴丸、片仔癀、血塞通等中成药大品种的主要药材成分［4］。全国以三七为原料的中成药品种有540 多种, 药品批号3 600 多个, 涉及制药企业1 350 多家，其中白药系列三七健康产品销售收入超过70 亿元。三七喜温暖阴湿，对于海拔、温度、水分等要求极其严格，其主要种植地集中在云南省文山州，然而，三七种植面临着严峻的连作障碍影响［5］，给七农造成的损失一般在5%-20%，严重的达70%，甚至绝收［6］。因此，三七连作障碍也成了三七种植产业健康发展迫切需要解决的难题。

土壤中真菌群落是土壤生态系统的重要部分，是土壤生态系统中有机质和大分子物质的分解者，不仅可以起到营养物质的传递和转运等作用，还能够改善土壤质地和结构，参与土壤中营养元素的生物化学循环，同时也会影响植物根际微生物的群落结构［7］，与细菌相比，土壤真菌能够更有效地利用碳源，对于恶劣环境更具优势。研究表明，真菌可以作为衡量土壤健康程度的指标［8］，真菌群落结构主要受到植被类型［9］或土地管理措施［10］的影响，不同类型土壤真菌群落组成和多样性存在明显差异［11-12］。土壤连作障碍产生的原因主要有根际土壤微生物群落变化、土传病虫害增加、化感物质积累及土壤理化性状恶变等多个方面［13］，其中土壤真菌群落变化被认为是引起三七病害的主导因子［14］。

前人在如何克服连作障碍上做了许多研究［15］。已有的研究表明，可以通过一些措施，如合理轮作、喷洒农药、土壤熏蒸、生防菌剂、土壤改良剂来减缓三七连作障碍的危害［16］。如Li 等［17］研究表明，生物炭对植烟土壤微生物群落有着促进作用，对植烟种植有较好的效果。Dangi 等［18］研究表明，使用生物炭或有机肥料会影响微生物群落PLFA 结构，微生物生物量、组成和辣椒产量。生物炭是生物质能原料在无氧环境条件下高温热解得到的富碳的有机物质［19］。相比其他改良剂，生物炭具有材料易得、价格便宜、能够显著提高作物产量、降低病害风险等特点，是较为理想的病害防治措施［20-21］。目前，生物炭在土壤中的应用研究主要关注沙化地、盐碱地土壤理化性质的改变，并刺激土壤微生物的活动，从而影响土壤质量和植物性能［22］等方面，有关土壤真菌群落特征（生物量、多样性和群落结构）的研究较少，尤其是对连作土壤恢复措施效果的对比研究更为稀少，对连作土壤真菌群落演变的主要驱动因子和机制还缺乏认知。

本团队前期的研究发现，生物炭能够提高三七主根产量，减低重金属胁迫，提高土壤有机质等［23］，然而这些作用效果在三七连作土壤真菌群落变化中起什么作用，能否通过生物炭的施用改善三七连作土壤真菌群落结构？值得进一步研究。因此，本研究通过高通量测序技术分析不同生物炭对三七根际土壤真菌群落结构的影响，并对土壤理化性质进行分析，旨在得出生物炭对连作地三七的改良机制，为三七产业的健康发展提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料

试验区位于传统的三七产区云南省文山州中国西南部的苗乡三七科学实验站（23°31′44″N,104°19′13″E）。该 区 亚 热 带 气 候，年 平 均 气 温16.6℃，年平均降水量1 111 mm，全年无霜期356 d。土壤以酸性红壤为主，富含铁和铝，至2020年，该试验区已连续种植三七5年。自从第一次移栽一年生三七籽条存活至收获以后，此后每年移栽一年生三七籽条均表现出常规栽培后籽条发病死亡。试验前土壤的基本理化性质为：pH 7.02，电导率 0.09 ms/cm，有机碳和总氮的含量分别为10.2 g/kg 和1.36 g/kg。供试生物炭分别为稻壳、烟杆在500℃ 厌氧热解后的产物，供试生物炭的基本理化性质如表1所示。

表1 生物炭基本性质Table 1 Basic properties of the biochar

1.2 方法

1.2.1 试验设计 在三七种植基地按照三七传统栽培方法，于2019年2月，将生长一年的三七籽条移栽到田间，移栽前在0-20 cm 表土中均匀掺入1 kg/m2复合肥作为基肥（肥料的配比为氮、磷、钾2∶1∶3 的比例进行配方施肥）及上述两种生物炭。试验共设置2 个处理，RB：添加18 t/hm2的稻壳炭［24］；TB：添加18 t/hm2的烟杆炭；以不添加生物炭为对照（CK），各处理均设置3 个重复。3 个处理均进行相同的田间管理（包括除草、灌溉等）。

1.2.2 土壤样品采集 在三七籽条生长1.5年后，于2020年9月对其成活率进行了调查，9月20日采集土壤样品。各处理每个小区按“S”形采样路线随机选取10 个采样点，采集0-20 cm 的耕层土壤，混合均匀后去除杂物和细根，过2 mm 筛。过筛后的新鲜土壤样品分成3 份：一份风干后测定土壤理化性质；一份保存在4℃用于测定土壤微生物活性；一份保存在-80℃用于土壤基因组DNA 的提取［25］。

1.2.3 土壤理化性质及酶的活性 土壤pH 值、硝态氮、铵态氮、有效磷、有效钾、有机质、总氮等理化性质的测定参照鲍士旦［26］的方法；土壤微生物量碳采用熏蒸浸提法测定［27］；土壤磷酸酶采用磷酸苯二钠比色法测定［28］、脲酶采用苯酚次氯酸钠比色法测定、蔗糖酶用3,5-二硝基水杨酸比色法［29］

1.2.4 土壤DNA 的提取与高通量测序 称取1 g三七根际土壤，用DNA 提取试剂盒（NucleoSpin Kit，Macherey-Nagel GmbH，Germany）提取样品总DNA。 使 用 引 物ITS1F：5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′ 和ITS2：5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′对真菌ITS 片段进行扩增。PCR 扩增产物使用AMPure XP 试剂盒（Beckman Coulter Life Sciences，USA）和QuantiFluorTM-ST 荧光定量系统（Promega，USA）进行纯化和定量，利用Illumina HiSeq2500PE250 进行高通量测序［30］。

1.2.5 数据分析与处理 通过FLASH V1.2.7［31］和Trimmomatic［32］软件对 Illumina HiSeq 双端测序数据进行拼接与过滤，使用UCHIME v4.2［33］去除嵌合体，并用Usearch 软件［34］对Reads 在97.0%的相似度水平下进行聚类，获得OTU（Operational Taxonomic Units）。使用 RDP 软件以真菌ITS UNITE数据库（https://unite.ut.ee/）为参照对不同 OTU 的代表性序列进行分类学注释。使用QIIME2 软件分析真菌样品Alpha 多样性指数和Beta 多样性进行分析评估。使用MOTHUR［35］软件和R 语言工具分析样品Shannon 指数、Chao1 并将样品所含序列数进行标准化处理；统计学分析使用SPSS Statistics 26 软件进行相关性分析和方差分析，显著水平为0.05，用Duncan 法（P<0.05）对处理间进行多重比较，采用Tukey 检验确定组间有显著性差异（P<0.05）；使用Canoco 4.5 软件分析真菌群落与土壤环境因子的关系，结构模型采用Amos 进行分析，使用Visio、Origin2021 作图。

2 结果

2.1 施加生物炭对土壤理化性质及酶活性的影响

由表2 可知，施加两种生物炭均可以显著提升三七籽条的成活率，施加稻壳炭（RB）和烟杆炭（TB）处理分别比对照（CK）提高了3.3 和3.1 倍。土壤理化性质分析结果表明，施加稻壳炭和烟杆炭处理显著增加了土壤pH 值和有效磷含量（P<0.05），显著降低了铵态氮含量（P<0.05），施加稻壳炭处理对硝态氮含量的影响不显著；施加烟杆炭处理却能够显著提高土壤硝态氮含量（P<0.05）；两组处理均降低了有效钾含量。施加生物炭均提高了土壤微生物量碳含量，但其影响并不显著。施用烟杆炭（TB）能显著提高土壤脲酶和酸性磷酸酶活性（P<0.05），分别比CK 提高22.7%和65.5%。但是，施用生物炭的2 个处理均显著降低了土壤蔗糖酶活性（P<0.05），相比对照, 稻壳炭和烟杆炭处理土壤蔗糖酶活性分别降低了48.9%和60.3%。稻壳炭处理土壤酸性磷酸酶和脲酶活性与对照相比没有显著性差异（P<0.05）。

表2 三七连作土壤的理化性质和土壤酶活性Table 2 Physicochemical properties and enzyme activities of soil for continuously cropping P. notoginseng

2.2 三七成活率与土壤理化性质及酶活性相关分析

由图1 可知，三七成活率与土壤pH 值、土壤微生物量碳含量（MC）呈极显著正相关（P<0.01），与土壤有效磷含量（AP）呈显著正相关（P<0.05），三七成活率与土壤酶活性呈正相关，但显著性不高（P>0.05）。此外，土壤铵态氮的含量与土壤酸性磷酸酶活性呈极显著正相关（P<0.01），土壤pH 值与有效磷含量（P<0.05）、土壤微生物量碳含量（P<0.05）呈显著正相关。。

2.3 施加不同生物炭对三七连作地真菌群落结构的影响

2.3.1 土壤真菌群落组成 根据物种注释结果，选取每个处理在门水平上最大丰度排名前10 的物种，生成物种相对丰度柱形累加图（附图1）。其中Ascomycota（子囊菌门），Basidiomycota（担子菌门）和Mortierellomycota（被孢菌门）为三七根际土壤优势真菌类群，其相对丰度分别为93.50%，95.91%和93.85%。但各处理优势类群在相对丰度上存在差异，施加生物炭后均显著升高了Ascomycota 的相对丰度，显著降低了Basidiomycota 及Mortierellomycota（被孢菌门）的相对丰度（P<0.05）。其中，与CK对比，RB 处理中Ascomycota 的丰度升高了23.84%，Basidiomycota 及Mortierellomycota 的丰度分别降低了55.25%、37.98%；TB 处理中Ascomycota 的丰度比CK 升高4.71%，Mortierellomycota 的丰度降低了33.31%。

图1 三七成活率与土壤理化性质及酶活性相关性描述分析Fig. 1 Descriptive analysis on the correlation between P. notoginseng's survival rates and soil physicochemical properties and enzyme activities

在属水平上，仅选取具有显著差异的真菌类群生成柱形图（图2）。其中Botryotinia（葡孢盘菌属）的丰度在各处理中差异显著（P<0.05），CK 中的丰度仅为0.056%，而RB 及TB 组的丰度分别为3.88%和0.19%；与CK 相比，RB 和TB 中Mortierella（被孢霉属）、Fusarium（镰刀菌属）、Aspergillus（曲霉菌属）和Alternaria（链格孢属）的相对丰度都显著降低。其中RB 处理对Mortierella，Fusarium及Aspergillus的影响最大，分别显著降低了51.22%，8.99%及12.0%；RB 处理对Alternaria的影响较大，显著降低了34.05%。Pearson 相关分析（图2）表明，三七成活率与Botryotinia的丰度呈正相关，与Mortierella，Fusarium，Aspergillus及Alternaria的 丰度呈负相关。

图2 属水平不同处理间真菌类群的相对丰度及其与三七成活率的皮尔逊相关系数Fig. 2 Abundance of fungal population among different treatments at the genus level in the rhizosphere soil and their Pearson’s correlation coefficients with P.notoginseng’s survival rates

2.3.2 施加生物炭对三七连作土壤真菌群落alpha 和beta 多样性多样性的影响 由表3 可知，烟杆生物炭处理土壤真菌OTUs 数量、Chao1 指数、Simpson指数及Shannon 指数，均显著高于稻壳生物炭处理和对照处理（P<0.05），表明施用烟杆生物炭对土壤真菌微生物数量和群落多样性均有提高。而稻壳生物炭处理土壤真菌OTUs 数量及Simpson 指数与对照之间没有显著差异，而 Chao1 指数显著低于对照，Shannon 指数显著高于对照，表明稻壳生物炭相比对照能够显著提高真菌的种类，但却降低真菌数量。

表3 三七连作土壤真菌群落alpha 多样性分析Table 3 Alpha diversity analysis of fungal community in soil for continuous cropping of P. notoginseng

基于Bray-Curitis 距离指数算法，对各处理间真菌群落进行UPGMA 聚类分析（附图2），CK 组土壤真菌群落单独聚为一类，RB 与TB 聚为一类，表明RB 与TB 真菌群落结构较为接近。

土壤pH 值及硝态氮含量与Simpson、Shannon指数均呈显著正相关（P<0.05）；微生物量碳与各项多样性指数均呈正相关，而铵态氮与有效钾与

2.4 土壤理化性质对真菌群落多样性及结构的影响

各项多样性指数均呈负相关，但均未达到显著水平（P<0.05）（图3-A）；由图3-B 可知，Ascomycota（子囊菌门）与有效钾呈显著负相关（P<0.05）；Basidiomycota（担子菌门）与铵态氮呈显著正相关（P<0.05）；Mortierellomycota（ 被 孢 霉 门） 与有效磷呈显著负相关（P<0.05）。图3-C 所示，Mortierella、Aspergillus与pH 呈 显 著 负 相 关（P<0.05）；Botryotinia及Penicillium与微生物量碳呈显著正相关（P<0.05）；Archaeorhizomyces与微生物量碳呈显著负相关（P<0.05）。

图3 土壤理化性质与真菌群落相对丰度及多样性指数相关性分析热图Fig. 3 Heatmap of correlation analysis between soil physicochemical properties and fungal community diversity index or relative abundance of soil fungal community

进一步探究土壤理化因子对三七根际真菌群落结构的影响。由图4-A 可知，基于门水平RDA分析第一排序轴与第二排序轴分别为 35.90%和24.37%，总解释率为 60.27%。3 个处理真菌群落分布在3 个不同象限。Ascomycota 与Basidiomycota及Mortierellomycota 呈钝角，属于负相关关系。Basidiomycota 与Mortierellomycota 呈 锐 角， 属 于正相关关系。Ascomycota 仅与有效钾及铵态氮呈正相关关系，与其他理化因子呈负相关关系。而Basidiomycota 及Mortierellomycota 与硝态氮呈负相关关系，Rozellomycota 与Chytridiomycota 均与有效钾呈正相关关系。

图4-B 的RDA 分析结果显示，前两轴解释率分别为 29.24%与 17.76%，总共可解释优势菌属分布趋势的 47.00%，Botryotinia与微生物量碳呈正相关关系，Mortierella、Sagenomella及Fusarium与微生物量碳呈负相关关系，Aspergillus及Talaromyces与有效磷呈正相关关系，Archaeorhizomyces与pH、硝态氮呈负相关关系，Penicillium与pH 呈正相关关系，Trichoderma仅与有效磷呈负相关关系。

图4 基于门（A）与属（B）水平土壤真菌群落结构与土壤理化性质间的冗余分析Fig. 4 Redundancy analysis between the soil fungal community and soil physicochemical properties based on phylum（A）and genus（B）level

图5 结构分析表明，pH 值、土壤有效磷、微生物量碳及有效钾对三七成活率具有促进作用，铵态氮对三七成活率具有抑制作用，其中，pH 值（0.746***）和有效磷（0.698***）贡献最大。此外，pH 值对Mortierellomycota 具有显著性抑制作用，其贡献率分别为-0.815***和-0.208***，而对Ascomycota 与Basidiomycota 为 正 贡 献。此 外，有效磷对Mortierellomycota 的抑制贡献度也较高（-0.208***），有效钾对Ascomycota 的抑制贡献度（-0.208***）也较高。

图5 土壤性质及真菌群落指标对三七苗成活率影响的结构模型Fig. 5 Structural model of the influence of soil properties and fungal community indicators on the survival rate of P. notoginseng seedlings

3 讨论

3.1 施加生物炭对连作三七土壤理化性质的影响

本研究中，三七的成活率与土壤中有效磷及微生物量碳的含量呈正相关，这可能是由于施入的生物炭中有效磷及碳氮含量较大的缘故。生物炭中含有大量的有机质碳且属于惰性碳库［36］，不易分解，因此恢复了连作土壤中碳元素的流失，提高了三七的成活率。生物炭中含有碱性物质，一般呈碱性，且特殊的结构能将盐基离子吸附在表面，使土体中含有较多碳酸盐和碳酸氢盐，水解后产生OH-，所以能提高土壤pH［37］，相关分析表明，三七连作土壤的pH 值与三七的成活率呈正相关。同时Xu 等［38］的研究表明，当土壤pH 值达到6.5 时，三七存活率最高。本研究中发现，三七成活率与土壤中有效钾含量呈负相关，这可能是由于土壤长期连作钾肥含量过高，土壤养分失衡所导致。单一营养元素的富集可导致病原微生物的增加。土壤微生物和功能酶对土壤中物质代谢功能具有重要的维持和推动作用，有研究表明提高酶活性有助于作物的生长，本研究发现施加生物炭对连作土壤酸性磷酸酶活性、脲酶活性均有不同程度提高，但影响并不显著［39］。可能是不同类型的生物炭随着时间的推移，提高土壤酶活性的能力在不同程度的降低。

3.2 施加生物炭对连作三七土壤真菌群落的影响

真菌具有很强的分解能力，能分解糖类和纤维素等物质，从而积累土壤中的有机质，还能改变植物根际微环境，增加作物的抗病性。因此，真菌群落结构对植物生长有着间接的影响。在本研究中施加生物炭后，真菌群落多样性表现出一定的差异性，施加生物炭组与对照组具有明显的分化特征。有研究表明，健康土壤中三七真菌群落多样性较高［40］，本研究中三七连作地中真菌群落多样性及丰富度较差，施加不同类型的生物炭均能够升高三七连作土壤真菌的物种丰富度和多样性，且施加烟杆炭后的处理组alpha 多样性最高。本研究结果显示，土壤真菌群落多样性指数受有效钾及微生物量碳影响，且pH 值及硝态氮对土壤真菌群落多样性指数影响显著。文东新等［41］以丘陵坡地紫色土为研究对象，发现有效磷与土壤微生物多样性指数呈显著正相关。李永赟等［42］的研究表明，硝态氮对植烟土壤多样性指数呈正相关。施用生物炭可以通过改变三七根际土壤理化性质，调节土壤真菌群落的多样性［43］。

连作障碍的发生会导致部分病原菌的产生，病原菌与真菌会发生拮抗作用，使根际土壤中真菌群落发生改变。通过本研究中RDA 及结构模型分析发现，子囊菌门（Ascomycota）在不同处理中均为优势菌群，子囊菌物种在土壤中分布广泛，其充当了生态系统中的分解者［44］，施加生物炭解决了土壤钾肥富集的问题从而使处理组中Ascomycota 丰度的提升（有效钾的抑制贡献度为-0.208***）；根据冗余分析中铵态氮与担子菌门（Basidiomycota）的相关性，导致担子菌门（Basidiomycota）丰度的下降，可能是由于土壤中铵态氮含量降低的原因，研究表明 Basidiomycota 往往会引起玉米小麦等农作物严重病害［45］，故本研究中，Basidiomycota 丰度降低缓解了连作对三七生长的危害；施加生物炭后的丰度降低。结构分析表明，pH 对Mortierellomycota 显著性抑制作用，其贡献率分别为-0.815***和-0.208***，而对Ascomycota 与Basidiomycota 为正贡献。此外，有效磷对Mortierellomycota 的抑制贡献度也较高（-0.208***）。研究表明被孢霉可补充氮素、溶解态磷、有机碳［46］，而本研究认为，Mortierellomycota丰度过高可能会导致磷元素富集，并不利于三七的生长。

在本研究中施加不同类型生物炭可以降低土壤中Fusarium，Alternaria等真菌的相对丰度。研究表明［47］Fusarium能引起白及、三七、西洋参等根茎类药用植物发生病害，且这些药用植物根腐病的发生伴随着土壤Fusarium丰度的快速增加。黄宇等［48］的研究表明Alternaria导致烟草感染白粉病。而这些病原菌丰度的降低可能是生物炭独特的孔隙结构产生的吸附效果。本研究还发现连作土壤中存在着大量的Mortierella和Aspergillus，这两种真菌的丰度与三七的成活率成负相关，且与土壤pH 值呈负相关，施加生物炭后土壤环境趋于中性导致其丰度降低。本研究发现施加生物炭后Botryotinia丰度升高，这可能是因为生物炭对土壤中碳源的补充。且本研究发现，Botryotinia可作为三七生防菌，抑制三七病原真菌的生长，这表明生物炭通过降低病原菌，增强对病原菌的拮抗作用，提高三七的成活率。

4 结论

施加生物炭可提高连作地三七籽条的成活率，施入生物炭后，可以显著提高土壤pH 值、有效磷及微生物量碳含量，有助于改善土壤环境，恢复土壤肥力。施加不同种类生物炭均显著改变了三七连作地土壤真菌群落结构，提高了真菌群落的多样性及丰富度，同时使三七连作土壤中病原菌丰度显著降低，从而提高了三七的成活率，为三七产区特色农业发展提供理论参考。

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