榆荚仁黄酮对慢性睡眠剥夺小鼠抗氧化能力的影响

李浩雨 徐兴军,2* 李雪涵 张泽鹏 张伟伟,2 邵淑丽,2

(1.齐齐哈尔大学生命科学与农林学院，齐齐哈尔161006；2.抗性基因工程与寒地生物多样性保护黑龙江省重点实验室，齐齐哈尔161006)

睡眠剥夺(sleep deprivation，SD)是指由于环境或自身原因不能满足正常睡眠的一种现象，包括急性睡眠剥夺和慢性睡眠剥夺，急性睡眠剥夺指快速的完全剥夺睡眠，而慢性睡眠剥夺指每日剥夺一定时间，持续几天甚至几个月[1]。慢性睡眠剥夺能够导致不同的生物学效应，例如神经自主控制改变、氧化应激损伤增加、炎症的产生以及凝血反应改变。Wang等[2]研究表明，慢性睡眠剥夺使小鼠肠道组织中抗氧化酶活性和总抗氧化能力降低，丙二醛含量升高，导致肠道出现氧化应激损伤。Konakanchi等[3]研究表明，慢性睡眠剥夺诱导的空间记忆障碍和焦虑样行为与氧化应激和海马CA3神经元的树突树枝状结构减少有关。易冲等[4]研究表明，睡眠剥夺能显著激活小鼠体内氧化应激反应。以上研究表明，慢性睡眠剥夺会损害动物的循环、内分泌、免疫、消化、生殖等系统，从而使机体的代谢功能出现紊乱，严重损害动物健康。同时，慢性睡眠剥夺是一种使动物处在应激环境的状态，而动物处于应激环境时所表现出来的行为变化及生理变化可称为动物性情，其与动物的生长性能、健康以及生产效率等方面密切相关[5]。

Ahmed等[6]研究表明，核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid-2 related factor 2，Nrf2)相关通路能够减轻睡眠剥夺诱导的神经炎症及氧化应激损伤。Tang等[7]研究表明，蛇床子素通过激活Nrf2/血红素氧合酶-1(heme oxygennase-1，HO-1)通路减轻了慢性睡眠剥夺诱导的认知缺陷。Nrf2是一种主要的内源性抗氧化调节因子，可介导活性氧(ROS)产生并维持氧化还原稳态[8]。HO-1是抗氧化的重要靶点，通常受Nrf2信号通路的调节，依赖还原型辅酶Ⅰ(Ⅱ)醌氧化还原酶1[NAD(P)H: quinine oxidoreductase 1，NQO1]是一类分布广泛的抗氧化酶，能够解除醌类物质对细胞的毒害，同样受到Nrf2的调节[9]，以上由Nrf2及Nrf2调控的下游抗氧化酶构成的信号通路在对抗氧化应激的反应中起关键作用[10]。

榆荚仁为荨麻目榆科植物榆树(UlmuspumilaL.)的种子，原产于中亚、中国北部和印度[11]。研究表明，从榆荚仁中分离出来的黄酮类物质具有良好的抗氧化活性[12]。虽然榆荚仁在中药领域已经有了广泛应用，但目前国内外对榆荚仁治疗睡眠障碍的研究尚未见报道，对其治疗睡眠障碍的机理仍不清楚。因此，本研究以不同浓度的榆荚仁黄酮连续灌胃慢性睡眠剥夺小鼠，从基因及酶学水平研究其对慢性睡眠剥夺小鼠大脑、肝脏和肠道中Nrf2、HO-1、NQO1基因表达及相关抗氧化酶活性的影响。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验动物：试验以购自长春市亿斯实验动物技术有限责任公司42只4周龄无特定病原体(SPF)级雄性ICR小鼠为研究对象，体重(22.00±2.00) g。

仪器设备：TECAN M1000酶标仪(帝肯上海贸易有限公司)；VORTEX-5旋涡混合器(德国IKA公司)；TS-DI-20L/H实验室超纯水设备(陶氏水处理设备工程有限公司)；恒温干燥箱(天津市南郊区东泥沽铁工厂)；大功率磁力加热搅拌器(江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司)；BS124S电子天平(德国赛多利斯股份公司)；TGL-16M高速台式冷冻离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)；DK-S26数显恒温水浴锅(上海三发科学仪器有限公司)；WD-9403D紫外仪(北京市六一仪器厂)；TH-86-340-LA(-80 ℃)超低温冰箱(北京天地精仪科技有限公司)；TGL-16C离心机(上海安亭科学仪器厂)；Applied Biosystems实时荧光定量PCR仪(美国应用生物系统公司)；2000/2000C Nanodrop(赛默飞世尔科技公司)；7220G可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)。

主要试剂：反转录试剂盒、实时荧光定量PCR试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒、HO-1酶联免疫吸附测定(ELISA)检测试剂盒、NQO1 ELISA检测试剂盒、8-羟基脱氧鸟苷(8-OH-dG)ELISA检测试剂盒均购自百杰斯生物公司。

1.2 试验设计

将适应性饲养1周后的42只SPF级4周龄雄性ICR小鼠按体重随机分为7组，分别为空白对照组、模型对照组、羧甲基纤维素钠(CMC-Na)对照组、阳性对照组、低浓度榆荚仁黄酮组(低酮组)、中浓度榆荚仁黄酮组(中酮组)和高浓度榆荚仁黄酮组(高酮组)，每组6只，各组间体重差异不显著(P>0.05)。利用改良多水平台睡眠剥夺法[13]对小鼠进行为期30 d的慢性睡眠剥夺，每日18 h(16:00至次日10:00)[14]，睡眠剥夺过程中保证昼夜节律稳定，温度适宜。

慢性睡眠剥夺30 d后，各组每天进行灌胃，低、中、高酮组分别灌胃30、60、120 mg/kg的榆荚仁黄酮，空白对照组(不再进行睡眠剥夺)灌胃等量的生理盐水，阳性对照组灌胃等量的褪黑素，模型对照组灌胃等量的生理盐水，CMC-Na对照组灌胃等量的0.5% CMC-Na溶液。各组小鼠自由饮食、饮水，室温下灌胃28 d。

1.3 样品采集和检测指标

1.3.1 慢性睡眠剥夺小鼠器官、血清样品制备

末次灌胃后禁食24 h，小鼠摘眼球法取血后采用断头法处死，冰上解剖并取出各脏器。血液离心制备成血清，各器官用预冷生理盐水冲洗后滤纸吸干，置于-80 ℃冰箱备用。

1.3.2 慢性睡眠剥夺小鼠抗氧化酶活性的测定

采用试剂盒法检测大脑、肝脏、肠道中HO-1、NQO1活性，并测定血清中8-OH-dG含量。

1.3.3 慢性睡眠剥夺小鼠抗氧化酶相关基因表达的测定

采用Trizol法提取总RNA，利用反转录试剂盒将Trizol提取后的总RNA反转录成cDNA。以cDNA为模板，采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测HO-1、NQO1、Nrf2的mRNA相对表达量。qRT-PCR反应体系15.0 μL，包括7.5 μL 2×qPCR Mix，1.5 μL 2.5 μmol/L基因引物，2.0 μL cDNA，4.0 μL ddH2O。反应条件如下：95℃预变性5min，95℃变性30s，60℃退火10 s，72 ℃延伸30 s，循环40次。循环后检测其溶解曲线，用甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)作内参基因，采用2-△△Ct计算目的基因的mRNA相对表达量。引物均由上海生物工程有限公司设计并合成，引物信息见表1。

表1 引物信息

1.4 数据统计分析

采用Graphpad Prism 8.0及SPSS 22.0软件进行作图及统计学分析。试验数据进行单因素方差分析，以平均值±标准差(mean±SD)表示。P<0.05表示差异显著，P>0.05表示差异不显著。

2 结果与分析

2.1 榆荚仁黄酮对慢性睡眠剥夺小鼠大脑、肝脏、肠道中HO-1、NQO1活性的影响

由表2可知，低、中、高酮组大脑中HO-1、NQO1活性均显著高于模型对照组和CMC-Na对照组(P<0.05)，表明榆荚仁黄酮对慢性睡眠剥夺小鼠大脑中HO-1、NQO1活性有明显提高作用；模型对照组和CMC-Na对照组大脑HO-1、NQO1活性差异不显著(P>0.05)，表明CMC-Na对小鼠大脑中抗氧化酶活性无明显影响。

表2 榆荚仁黄酮对慢性睡眠剥夺小鼠大脑、肝脏、肠道中HO-1、NQO1活性的影响

低、中、高酮组肝脏中HO-1、NQO1活性均显著高于模型对照组和CMC-Na对照组(P<0.05)，表明榆荚仁黄酮对慢性睡眠剥夺小鼠肝脏中HO-1、NQO1活性有明显提高作用；模型对照组和CMC-Na对照组肝脏中HO-1、NQO1活性差异不显著(P>0.05)，表明CMC-Na对小鼠肝脏中抗氧化酶活性无明显影响。

低、中酮组肠道中HO-1、NQO1活性均显著高于模型对照组和CMC-Na对照组(P<0.05)，表明荚仁黄酮对慢性睡眠剥夺小鼠肠道中HO-1、NQO1活性有明显提高作用；模型对照组和CMC-Na对照组肠道中HO-1、NQO1活性差异不显著(P>0.05)，表明CMC-Na对小鼠肠道中抗氧化酶活性无明显影响。

2.2 榆荚仁黄酮对慢性睡眠剥夺小鼠血清8-OH-dG含量的影响

由图1可知，小鼠血清8-OH-dG含量从高到低依次为模型对照组>CMC-Na对照组>高酮组>低酮组>阳性对照组>中酮组>空白对照组。模型对照组和CMC-Na对照组小鼠血清8-OH-dG含量显著高于其他各组(P<0.05)。

数据柱标相同小写字母表示差异不显著(P>0.05)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下图同。

2.3 榆荚仁黄酮对慢性睡眠剥夺小鼠抗氧化基因表达的影响

2.3.1 榆荚仁黄酮对慢性睡眠剥夺小鼠大脑中Nrf2、NQO1和HO-1 mRNA相对表达量的影响

由图2可知，阳性对照组及低、中、高酮组大脑中Nrf2、NQO1和HO-1 mRNA相对表达量均显著高于空白对照组、模型对照组和CMC-Na对照组(P<0.05)。

图2 榆荚仁黄酮对慢性睡眠剥夺小鼠大脑中Nrf2、NQO1、HO-1 mRNA相对表达量的影响

2.3.2 榆荚仁黄酮对慢性睡眠剥夺小鼠肝脏中Nrf2、NQO1和HO-1 mRNA相对表达量的影响

由图3可知，阳性对照组及低、中、高酮组小鼠肝脏中Nrf2、NQO1和HO-1 mRNA相对表达量均显著高于空白对照组、模型对照组和CMC-Na对照组(P<0.05)。

图3 榆荚仁黄酮对慢性睡眠剥夺小鼠肝脏中Nrf2、NQO1、HO-1 mRNA相对表达量的影响

2.3.3 榆荚仁黄酮对慢性睡眠剥夺小鼠肠道中Nrf2、NQO1和HO-1 mRNA相对表达量的影响

由图4可知，阳性对照组及中、高酮组小鼠肠道中Nrf2、NQO1和HO-1 mRNA相对表达量均显著高于模型对照组和CMC-Na对照组(P<0.05)，低酮组肠道中NQO1和HO-1 mRNA相对表达量与空白对照组比差异不显著(P>0.05)。

图4 榆荚仁黄酮对慢性睡眠剥夺小鼠肠道中Nrf2、NQO1、HO-1 mRNA相对表达量的影响

3 讨 论

氧化应激是由细胞和组织中ROS的产生和积累造成的[15]，并且与多种疾病有关，如癌症、免疫缺陷疾病、神经系统疾病和心血管疾病等，此外它与自由基的过多产生有关[16]。自由基是含有1个或多个不稳定电子的化学物质，去除这些原子中的电子则可以达到一个稳定的状态[17]。植物中的黄酮类化合物可以通过增加尿酸水平、金属螯合活性和抗氧化活性，以减轻氧化应激损伤[18]。而榆荚仁黄酮中的酚羟基可以和自由基产生性质较稳定的半醌自由基(semiquinone radical，UQH)，导致自由基链式反应被终止，因此能够提高机体的抗氧化能力。

Son等[19]研究发现，木犀草素可通过激活Nrf2，上调HO-1、NQO1等抗氧化酶的表达，最终对铬诱导的恶性细胞转化起保护作用。Zhang等[20]研究发现，灯盏花乙素通过激活Nrf2相关通路，进一步上调相关抗氧化酶的表达。本试验测定了小鼠大脑、肝脏和肠道中HO-1、NQO1活性的变化，结果显示，榆荚仁黄酮均能提高慢性睡眠剥夺小鼠大脑、肝脏和肠道中HO-1、NQO1活性，以中酮组效果最为明显，与上述研究相符。HO-1能够通过催化血红素转化为胆红素、游离铁和一氧化碳发挥抗氧化作用[21]。而NQO1能够将不同链长的辅酶Q(CoQ)底物还原为它们的抗氧化氢醌形式，并且在自由基攻击后再生抗氧化形式的α-生育酚(维生素E)，进而减轻氧化应激损伤[22]。榆荚仁黄酮通过增强相关抗氧化酶活性，从而减轻慢性睡眠剥夺造成的氧化损伤。

Wang等[23]研究发现，山楂叶总黄酮能够显著提高非酒精性脂肪性肝炎大鼠肝脏组织中Nrf2、NQO1、HO-1的mRNA相对表达量，进而在抗氧化应激过程中发挥重要作用。Wu等[24]研究发现，金合欢素通过激活Nrf2上调HO-1表达，发挥心肌保护作用。上述研究表明，Nrf2在细胞防御自由基损伤方面发挥着重要作用[25]。睡眠剥夺会导致氧化应激损伤，而Nrf2相关通路是抗氧化应激的关键信号通路，在氧化应激的条件下，Nrf2会被激活并转移到细胞核，然后与抗氧化反应元件(ARE)结合，导致特定位点的基因后续表达[26-29]。Nrf2能够编码代谢和抗氧化蛋白的基因，如NQO1、HO-1、谷胱甘肽S转移酶A2(GSTA2)、谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基(GCLC)等；并调控相关抗氧化酶的表达，进而清除ROS等有害物质，保持氧化还原平衡[30]。因此，针对Nrf2的抗氧化治疗，可能在治疗慢性睡眠剥夺相关方面发挥重要作用。本试验以30、60、120 mg/kg的榆荚仁黄酮灌胃慢性睡眠剥夺小鼠，结果表明，慢性睡眠剥夺小鼠大脑、肝脏和肠道中Nrf2、HO-1和NQO1的表达下调，灌胃榆荚仁黄酮后，Nrf2 mRNA相对表达量呈现上升趋势。本试验结果与上述研究结果一致，可能是由于榆荚仁黄酮能消除体内自由基，缓解其对细胞的氧化损伤，使Nrf2核转位增强，提高Nrf2 mRNA相对表达量，进而提高慢性睡眠剥夺小鼠大脑、肝脏和肠道中HO-1、NQO1 mRNA相对表达量。而HO-1、NQO1 mRNA相对表达量虽然也呈现出上升趋势，但未表现出明显的规律，可能是Nrf2为抗氧化相关通路的关键因子，榆荚仁黄酮表现出的抗氧化活性对其作用更为明显，而HO-1、NQO1还受到其他因子的调控，如蛋白激酶C-α(PKC-α)、芳香烃受体(aryl hydrocarbon receptor，AhR)、芳香烃受体核转位因子(AhR nucleart ranslocator，ARNT)等[31-32]，榆荚仁黄酮对相关因子的作用效果未知。

8-OH-dG通常作为DNA氧化损伤的评价指标[33]。本试验结果表明，慢性睡眠剥夺会导致血清8-OH-dG含量增加，说明慢性睡眠剥夺会造成机体DNA氧化损伤，经过灌胃榆荚仁黄酮后，血清8-OH-dG含量降低，其原因可能是榆荚仁黄酮通过清除慢性睡眠剥夺小鼠体内自由基与上调抗氧化酶的活性来缓解小鼠因慢性睡眠剥夺所致的氧化应激，从而使血清8-OH-dG含量降低，进而减少小鼠因慢性睡眠剥夺所致的DNA氧化损伤。

综上所述，榆荚仁黄酮能改善慢性睡眠剥夺小鼠大脑、肝脏、肠道的氧化应激状态，提高慢性睡眠剥夺小鼠大脑、肝脏、肠道中HO-1、NQO1活性，降低血清8-OH-dG含量，提高大脑、肝脏、肠道中HO-1、NQO1和Nrf2 mRNA相对表达量。

4 结 论

① 榆荚仁黄酮可降低慢性睡眠剥夺小鼠血清8-OH-dG的含量，改善DNA的氧化损伤。

② 榆荚仁黄酮可提高慢性睡眠剥夺小鼠大脑、肝脏和肠道中HO-1、NQO1活性和Nrf2、HO-1、NQO1 mRNA相对表达量，改善各器官的氧化应激损伤。