开食料中玉米加工方式对羔羊血清生化指标和瘤胃代谢组的影响

杨瑞鑫 李 勇,2 蔡小芳 韩铖星 郭艳丽*

(1.甘肃农业大学动物科学技术学院，兰州730070；2.河南农业职业学院牧业工程学院，郑州451450)

反刍动物的瘤胃发育是一个复杂的过程，涉及营养和生理信号之间的相互作用[1]。补饲开食料有利于瘤胃的早期发育，提高养分的消化吸收，促进反刍动物的生产性能[2]。研究表明，能量饲料的加工方式是影响开食料营养价值的重要因素之一。玉米是反刍动物开食料中最常使用的能量饲料。开食料中玉米的加工方式包括粉碎、破碎、干辗压、挤压膨化和蒸汽压片等[3-4]。有关开食料中玉米加工方式的比较研究结果表明，开食料中的玉米经过蒸汽压片处理有助于增加犊牛瘤胃中内切葡聚糖酶的稳定性和β-葡萄糖苷酶的活性，提高瘤胃纤维分解菌的活性和微生物蛋白合成，促进瘤胃发育[5]，减少尿氮排泄[6]，升高血液中β-羟丁酸盐和非酯化脂肪酸的浓度[7]。但以上报道多以犊牛为研究对象，以羔羊为试验动物的研究较少。仅有的研究结果表明，与磨碎的玉米相比，含有加工过的玉米(浸泡48 h)的饲粮提高了羔羊瘤胃乳头高度和上皮厚度[8]。本团队前期的研究结果表明，由蒸汽压片玉米(steam-flaked corn，SFC)构成的开食料比由粉碎玉米(ground corn，GC)构成的开食料促进了湖羊羔羊早期断奶前后的瘤胃[9]和小肠发育，提高了养分的消化率[10]，使瘤胃微生物组发生改变[11]，促进了羔羊早期采食量以及体重、体尺的提高[9]。

代谢组学可以迅速、全面和准确地反映饲粮、营养供给种类和供给量及饲养环境变化所引起的动物体内小分子代谢物的变化过程，通过代谢物差异对比及代谢途径分析可以揭示其营养代谢机制和调控作用机理[12]。营养物质进入瘤胃后经微生物发酵产生挥发性脂肪酸、氨基酸、肽以及其他代谢产物，最终被各个组织器官利用或排出。因此，使用代谢组学方法，可以较为系统地反映瘤胃内营养与代谢的复杂关系。但是，有关开食料中玉米加工方式对羔羊瘤胃代谢组影响的研究尚未见报道。

本试验就不同加工方式玉米构成的开食料对羔羊血清生化指标和瘤胃代谢组的影响进行研究，以揭示不同开食料对羔羊瘤胃发育影响的机理。

1 材料与方法

1.1 试验设计

选择24只平均体重为(5.04±0.75) kg的健康、体况良好的8日龄湖羊公羔(购自甘肃省白银市康瑞种羊养殖公司)，随机分为2组，每组12只。2组羔羊分别饲喂含粉碎玉米和蒸汽压片玉米的开食料，饲喂至42日龄饲养试验结束。

1.2 饲养管理

羔羊出生后，跟随母羊哺乳，4日龄开始诱饲代乳粉，8日龄断母乳，分组，单笼饲养。所有羔羊按体重的2%饲喂代乳粉(每天分3次等量饲喂)，同时开始饲喂开食料(自由采食)，自由饮水，在35日龄停止饲喂代乳粉，其他按照肉羊常规饲养管理程序进行[13]。

1.3 开食料组成、营养水平

参考NRC(2007)肉羊饲养标准设计开食料配方(表1)。开食料委托甘肃傲农饲料科技有限公司(武威)进行加工。粉碎玉米组是将所有原料粉碎后环模制粒(温度84～86 ℃；压缩比1∶5；直径6 mm)；蒸汽压片玉米组是将玉米进行蒸汽压片处理，然后破碎成4～5 mm的小块(方便羔羊采食)，除玉米外的其他原料以粉碎玉米组的制粒工艺制成颗粒料，然后在饲喂时将破碎的蒸汽压片玉米和颗粒料按比例混合均匀。

表1 开食料组成及营养水平(风干基础)

1.4 样品采集

分别在断奶前的21日龄和断奶后的42日龄的早饲前(禁食12 h)，从每组随机选择6只羔羊，颈静脉采集约10 mL血液于抗凝采血管中，制备血清，保存于-20 ℃备测血清生化指标。采血后将羔羊屠宰，收集瘤胃内容物，装入EP管，迅速置于液氮中，后转入-80 ℃保存，备测代谢组(断奶前每组5个样本，断奶后每组6个样本)。

1.5 测定指标及方法

1.5.1 血清生化指标

采用试剂盒(购自南京建成生物工程研究所)测定血清中葡萄糖(GLU)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、尿素氮(UN)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、β-羟丁酸(BHBA)的浓度及乳酸脱氢酶(LDH)、碱性磷酸酶(AKP)、谷草转氨酶(AST)的活性。

1.5.2 瘤胃代谢组

委托北京诺禾致源科技股份有限公司(中国)完成瘤胃代谢组学分析。样品经预处理后采用液相色谱-质谱(LC-MS)检测。采用Hyperil Gold column(C18)色谱柱；正离子模式：流动相A为0.1%甲酸，流动相B为甲醇；负离子模式：流动相A为5 mmol/L醋酸铵(pH 9.0)，流动相B为甲醇；柱温40 ℃，流速0.2 mL/min。质谱条件：毛细管温度320 ℃，鞘层气体压力35 psi，辅助气体流速3 L/min；电喷雾电离源(ESI源)：喷雾电压3.2 kV，扫描范围为100～1 500 m/z。

1.6 数据统计及分析

用SPSS 20.0统计软件对血清生化指标进行独立样本t检验，以P<0.05作为差异显著性标准。用Meta X软件对瘤胃代谢物进行主成分分析(PCA)和偏最小二乘判别分析(PLS-DA)。利用PLS-DA模型，通过变量投影重要度(VIP)和差异倍数(FC)，并结合t检验的P值来鉴定差异代谢物，以VIP>1.0、FC>2或FC<0.5且P<0.05为筛选标准。用KEGG数据库研究代谢物的功能和代谢通路，以P<0.05作为关键代谢通路的判别标准。

2 结果与分析

2.1 血清生化指标

由表2可知，蒸汽压片玉米组血清中尿素氮和β-羟丁酸的浓度在断奶前、后均显著高于粉碎玉米组(P<0.05)，断奶前分别提高42.84%和24.74%，断奶后分别提高66.33%和14.32 %；所测其他血清生化指标2组间无显著差异(P>0.05)。

表2 开食料中玉米不同加工方式对羔羊血清生化指标的影响

2.2 瘤胃代谢组

2.2.1 PCA和PLS-DA

由PCA(图1)可知，2组样本均能较好地聚集在一起，可进一步分析研究2组的瘤胃代谢物差异。在PLS-DA模型(图2)中，2组样本被明显地区分开，说明2组羔羊瘤胃代谢物存在明显差异。由置换检验结果(图3)可以看出，代表模型解释率的R2和代表模型预测率的Q2均表现良好，说明该模型对2组样本的区分有较好的解释和预测。

a：断奶前正离子模式；b:断奶前负离子模式；c：断奶后正离子模式；d:断奶后负离子模式。图2和图3同。

图2 PLS-DA散点图

图3 置换检验结果

2.2.2 差异代谢物

经LC-MS检测、预处理和过滤后，共得到2 748个正离子和1 158个负离子代谢物。采用PLS-DA模型第1主成分的VIP值，以VIP>1.0、FC>2或FC<0.5且P<0.05为标准进行筛选后，共得到862个差异代谢物。与粉碎玉米组相比，蒸汽压片玉米组在断奶前、后分别有398和60个代谢物的相对浓度显著增加，显著降低的代谢物分别有97和307个(图4)。

图4 差异代谢物

进一步就与瘤胃发育密切相关的代谢物[14]进行筛选，其中的差异代谢物见表3。与粉碎玉米组相比，在断奶前，蒸汽压片玉米组天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、乙酰胆碱、5-羟色胺和戊二酸的相对浓度显著增加，柠檬酸、D-葡萄糖酸、蔗糖和α-D-葡萄糖-1,6-二磷酸的相对浓度显著降低；断奶后，蒸汽压片玉米组的3-磷酸甘油醛的相对浓度显著增加，苯丙氨酸、花生四烯酸、泛酸、琥珀酰胆碱和烟酰胺的相对浓度显著降低。

2.2.3 差异代谢物富集通路

由图5可知，在断奶前，正离子差异代谢物主要富集到α-亚麻酸代谢、cAMP信号通路、味觉传导(图5-A)；负离子差异代谢物主要富集到氨酰-tRNA生物合成，ABC转运蛋白，精氨酸和脯氨酸代谢，组氨酸代谢，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢(P<0.05)(图5-B)；在断奶后，正离子差异代谢物主要富集到细胞色素P450对外源性药物代谢、FcεRI信号通路以及磷酸盐和亚磷酸盐代谢(图5-C)；负离子差异代谢物主要富集到萜类化合物主链的生物合成(图5-D)。

表3 瘤胃发育密切相关的差异代谢物

图中纵坐标为富集通路，横坐标为比例(通路中差异代谢物的数目/该通路中鉴定出总代谢物数目)，点的颜色代表P值的-log10值，点的大小代表相应通路中差异代谢物的数目。

3 讨 论

血液(血清)生化指标能够直接反映机体的营养水平、代谢和健康状况[15]。血液中的尿素氮是反刍动物体内可循环利用的含氮有机物代谢的终产物，可作为蛋白质代谢和饲粮氨基酸平衡的重要指标。尿素氮的一部分随血液重新返回瘤胃，构成瘤胃氮素循环[16]。本试验中，蒸汽压片玉米组羔羊在断奶前、后血清中尿素氮的浓度均显著高于粉碎玉米组的结果说明，含蒸汽压片玉米的开食料可能更有利于羔羊对氮的再利用。阿米娜木·司马义[17]用犊牛所做的试验得到类似结果，与颗粒化开食料相比，采食含蒸汽压片玉米开食料的犊牛血清中尿素氮的浓度显著较高。β-羟丁酸被认为是瘤胃上皮细胞发育成熟的标志，在瘤胃中由挥发性脂肪酸代谢产生的β-羟丁酸可以通过瘤胃基底层外侧的单羧酸转运蛋白运输至血液。β-羟丁酸也是组织生长、细胞增殖的重要调节因子，可通过促进瘤胃脂类代谢相关基因，刺激能量生成水平和瘤胃乳头发育[18]。本试验中，蒸汽压片玉米组羔羊在断奶前、后血清中β-羟丁酸的浓度均显著高于粉碎玉米组，说明玉米经蒸汽压片处理后可能更有利于β-羟丁酸的生成与运输，从而刺激瘤胃发育。Rastgoo等[19]得到类似结果，与粉碎玉米相比，饲喂含蒸汽压片玉米开食料的犊牛血清中β-羟丁酸的浓度升高。

代谢组学是对代谢机制的研究，通过测量整个生物样本中的代谢产物并通过阐明潜在的化学过程来实现的[20]。反刍动物的表型特征受瘤胃微生物群的影响，其功能可以通过瘤胃代谢物来反映[21]。不同种类的微生物所调控的代谢通路是不同的，从而影响代谢物的生成。不同的代谢物及不同的代谢通路会影响相关组织器官的发育[22]。本课题组前期研究结果表明，由蒸汽压片玉米构成的开食料更有利于羔羊断奶前、后的瘤胃发酵以及优势菌群的建立[11]，反映在本试验中则是2组羔羊的瘤胃代谢物显著不同。Saleem等[23]研究发现，饲喂不同谷物含量饲粮的奶牛，其瘤胃代谢物有显著差异。本课题组前期研究还发现，蒸汽压片玉米组羔羊的采食量始终高于粉碎玉米组，且在后2周差异显著[9]；在组织形态上，蒸汽压片玉米组羔羊的瘤胃乳头高度、乳头宽度、肌层厚度和相对重量均较粉碎玉米组显著增加[10]。结合本试验结果，说明含蒸汽压片玉米的开食料可能通过增加羔羊采食量、促进瘤胃发酵、帮助优势菌群建立，进而改变了瘤胃内的代谢物及其代谢通路，并最终促进了羔羊在断奶前、后瘤胃的发育。

氨基酸对微生物的生长和新陈代谢有重要作用，其也是蛋白质和多肽合成的关键成分，并调节多种代谢通路[24]。天冬氨酸是一种非必需氨基酸，是瓜氨酸转化为精氨酸的代谢途径所必须的[25]，天冬氨酸还可以转化为草酰乙酸参与三羧酸循环过程。精氨酸主要参与三羧酸循环和尿素循环[26]。组氨酸可在组氨酸脱羧酶的作用下转化为组胺，具有强烈的舒血管作用。组氨酸也是一种神经递质，参与神经调节，刺激胃酸和胃蛋白酶的分泌[27]。谷氨酸是三羧酸循环中间底物的最大贡献者，饲粮组成可能通过三羧酸循环来改变瘤胃上皮细胞中谷氨酸的分解代谢[28]。本试验中，蒸汽压片玉米组羔羊断奶前瘤胃中天冬氨酸、组氨酸和谷氨酸的相对浓度显著升高的结果说明，含蒸汽压片玉米的开食料可能通过增加三羧酸循环和尿素循环的底物、刺激味觉受体以及参与神经调节促进瘤胃发育。还有研究报道，瘤胃中天冬氨酸、谷氨酸浓度与血浆尿素浓度之间存在很强的相关性，这3种代谢物都参与反刍动物体内的尿素氮代谢，表明瘤胃和血液中的氮代谢是共同调节的[29]，饲喂含蒸汽压片玉米的开食料可能使多余的氨(NH3)进入宿主循环，随后在肝脏转化为尿素，从而使血液中尿素氮浓度升高。苯丙氨酸在体内通常会被相关酶催化分解为多种活性物质，如神经递质、激素和酪氨酸等，对动物的生理活动产生影响[22]。此外，苯丙氨酸属于生糖兼生酮氨基酸，在体内可转化为糖或酮体等物质参与能量代谢。本试验中，断奶后蒸汽压片玉米组羔羊瘤胃内苯丙氨酸浓度降低可能是因为含蒸汽压片玉米的开食料使瘤胃内分解代谢增强，苯丙氨酸转化为了糖、酮体或其他活性物质，参与瘤胃内代谢。

蔗糖在动物体内的利用需要被水解成果糖和葡萄糖[30]。葡萄糖在无氧的情况下进入糖酵解途径生成丙酮酸，在有氧条件下生成乙酰辅酶A，参与三羧酸循环[31]。葡萄糖酸由葡萄糖氧化而来，是重要的供能物质。本试验中，蒸汽压片玉米组羔羊瘤胃中的蔗糖和D-葡萄糖酸的相对浓度显著降低，可能是这些代谢物进入糖酵解过程的结果。3-磷酸甘油醛是糖酵解过程的重要中间产物，由果糖-1,6-二磷酸转化而来，蒸汽压片玉米组3-磷酸甘油醛的相对浓度显著上升，同样说明可能更多的蔗糖和D-葡萄糖酸进入了糖酵解从而产生了更多的中间产物。柠檬酸是三羧酸循环重要的中间产物，由乙酰辅酶A和草酰乙酸缩合而成，但是在本试验中，蒸汽压片玉米组羔羊瘤胃中柠檬酸的相对浓度显著降低，具体的原因还有待进一步研究。

胃肠道中存在许多神经递质，如去甲肾上腺素、5-羟色胺和乙酰胆碱等，能够调节胃肠运动、黏膜血管扩张、血流增加和物质吸收等[32]。本试验中，蒸汽压片玉米组羔羊瘤胃内的乙酰胆碱和5-羟色胺的相对浓度显著升高的结果说明，含蒸汽压片玉米的开食料可能更有利于刺激胃肠神经系统分泌较多的神经递质，促进瘤胃的发育以及营养物质的吸收。

花生四烯酸在体内分布广泛，可在环氧合酶的作用下生成前列腺素E2，前列腺素E2是一种重要的细胞生长因子和调节因子。本试验中，蒸汽压片玉米组羔羊瘤胃内花生四烯酸的相对浓度显著降低，原因可能是花生四烯酸被催化生成前列腺素从而刺激瘤胃细胞的生长。

B族维生素具有许多不同的功能，通常在生化反应中充当辅酶或辅助因子[33]。瘤胃微生物可以合成B族维生素。烟酸及其衍生物烟酰胺通常转化为烟酰胺腺嘌呤二核甘酸(NAD)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)发挥作用[23]。本试验中，蒸汽压片玉米组羔羊瘤胃内泛酸和烟酰胺的相对浓度均显著降低的结果说明，开食料中玉米的加工方式会影响瘤胃中的此类维生素的生成。有研究表明，玉米的粉碎粒度会影响瘤胃中B族维生素的生物合成，与大颗粒(过6 mm筛)相比，小颗粒(过2 mm筛)可以增加烟酸、钴胺素和叶酸的合成量，减少核黄素的降解量[34]。本试验中，蒸汽压片玉米组羔羊瘤胃中泛酸和烟酰胺的相对浓度显著降低可能是因为蒸汽压片玉米影响了瘤胃内维生素代谢，使瘤胃内降解或吸收量大于合成量，具体原因还需要进一步研究。

4 结 论

与含粉碎玉米的开食料相比，含蒸汽压片玉米的开食料显著增加了羔羊血清中尿素氮、β-羟丁酸的浓度，显著增加了瘤胃代谢物中天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸和3-磷酸甘油醛等的相对浓度，显著降低了瘤胃代谢物苯丙氨酸、花生四烯酸、柠檬酸、蔗糖和葡萄糖酸等的相对浓度，并改变了相关代谢途径，这可能是其较含粉碎玉米的开食料更能促进羔羊瘤胃发育的一个重要原因。