气调贮藏对瑞雪苹果的保鲜效果与果皮褐变机制的初探

高名月，赵政阳，王燕，梅振芳，牛军鹏，王雷存，惠伟,3*

1(陕西师范大学 生命科学学院，陕西 西安，710000)2(西北农林科技大学 园艺学院，陕西 咸阳，712000)3(陕西师范大学 西部果品资源高值利用教育部工程研究中心，陕西 西安，710000)

瑞雪苹果(Malusdomesticacv Ruixue)是西北农林科技大学以秦富1号和粉红女士杂交培育的黄色晚熟苹果新品种，丰产稳产、抗逆性强、肉质细脆、酸甜可口、果面洁净、香气诱人，是内外品质兼优的上等果[1]。瑞雪在陕西省已经推广栽培10万亩，售价是富士苹果的2～4倍，未来具有巨大的发展潜力。不套袋的瑞雪耐贮藏，套袋瑞雪果面洁净，呈黄绿色，具有引人注目的品相。但套袋瑞雪在采收前后，有部分果实梗洼处出现果皮褐变，冷藏过程中也有进一步发展趋势，影响了这一新品种的推广[2]。因此，为控制套袋瑞雪果皮的褐变现象，降低其造成的损失，寻找合适的贮藏方式具有重要意义。同时，探究套袋瑞雪贮藏期间果皮褐变的原因，可为减少瑞雪果皮褐变提供理论依据。

目前我国苹果主要以冷藏(cold storage，CS)方式贮藏保鲜，气调贮藏(controlled atmosphere，CA)占比在10%以下，发达国家的苹果气调贮藏占总贮藏量的40%以上[3]。冷藏仅通过控制温度和湿度来延缓果实衰老，而气调贮藏是在冷藏的基础上，进一步控制环境中的二氧化碳和氧气的比例浓度，具有比冷藏更显著的保鲜效果[4]。在苹果、梨、猕猴桃、四季豆等多种果蔬上的研究发现，气调贮藏可以有效抑制果蔬的呼吸强度，维持较高的抗氧化酶活性，从而提高贮藏品质[5]。目前生产中，苹果气调贮藏O2体积分数一般为2%～4%，CO2体积分数为3%～5%，但富士苹果对CO2较为敏感，前人研究表明，冷藏条件下控制环境中CO2体积分数不超过2%，方可显著延缓果实衰老，保持贮藏品质，如果CO2>4%，则会出现不可逆的CO2伤害[6]。任小林等[7]认为富士苹果果肉致密，不利于气体交换，因此不耐高CO2，气调贮藏时的CO2浓度要始终低于O2浓度。瑞雪苹果为富士芽变株系秦富1号的子代，继承了果肉致密的特点，因此推测瑞雪苹果也不耐高CO2，本研究参照富士苹果的气调贮藏条件来研究气调贮藏对瑞雪果皮褐变的影响。

目前学术界初步认为瑞雪果皮褐变是一种生理性病害，根据其发病时机和表现，初步认为与果皮抗氧化能力下降有关。研究表明，果皮褐变主要是酚类物质在多酚氧化酶(polyphenol oxidase, PPO)的催化下被氧化为醌，随后进一步被氧化成醌衍生物，最后积聚成不溶性黑色聚合物所导致[8]。此外，果皮褐变与抗氧化物质含量和抗氧化酶活性降低密切相关，由于果皮细胞膜系统受到自由基攻击，细胞的区域化结构破坏，导致贮藏期果皮发生褐变[9-10]。李静[11]发现，瑞雪果皮褐变可能与类黄酮含量降低、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)和过氧化物酶(peroxidase, POD)活性降低相关。

由于瑞雪苹果是新品种，在不同贮藏条件下的贮藏潜力尚未报道，气调贮藏的低O2、高CO2环境对控制苹果的虎皮病等果皮褐变有显著效果。目前关于套袋瑞雪果皮褐变的研究主要集中在采前套袋类型的影响方面[2,11]，并未涉及采后贮藏保鲜技术对贮藏期果皮褐变影响的研究，也未见有关瑞雪苹果气调贮藏的报道。因此，本研究对比了冷藏(0 ℃)和气调贮藏2种方式对瑞雪苹果采后果实贮藏期生理品质、果皮褐变的影响，同时关注果皮褐变与抗氧化能力的变化规律，为初步揭示瑞雪果皮褐变机理提供证据。

1 材料与方法

1.1 材料

于2018年10月22日，在陕西省白水县商业果园采收套袋的瑞雪苹果，采摘时挑选大小均匀、成熟度一致、无机械损伤和无病虫害的果实。果实采后当日运至陕西华圣果业有限公司，次日放于气调库和冷库中。由于瑞雪苹果为富士芽变株系秦冠的子代，因此本研究气调贮藏指标参考富士苹果气调贮藏指标，具体指标如下：2%～3% O2+1%～1.5% CO2，(0±0.5) ℃，相对湿度为90%～95%；冷藏指标是(0±0.5) ℃，相对湿度为90%～95%。

在210 d贮藏期，各处理每30 d随机取8个苹果，重复3次。取出后立即带回实验室，测定常规生理指标后将果实果皮(厚度约0.5 mm)、果肉分开，并用液氮把果皮速冻，然后保存到-80 ℃冰箱，用于后续实验。

1.2 仪器和设备

FT-327型果实硬度计，意大利Effegi公司；PAL-1数显手持糖度计，日本ATAGO公司；TU-1810分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；Fresco17台式离心机，赛默飞世尔科技(中国)有限公司。

1.3 指标测定

1.3.1 果皮褐变率和褐变指数的测定

在2种贮藏条件下各随机挑选50个果实用来统计瑞雪果皮的褐变率和褐变指数。

果皮褐变率计算如公式(1)所示：

(1)

果皮褐变指数参考DUAN等[12]，根据苹果果实的褐变程度(褐变面积占整个果实表面积的百分比)，可将褐变苹果的严重性分为4个等级：0级为果实无褐变情况；1级为果实褐变面积≤25%；2级为果实褐变面积为25%～50%；3级为果实褐变面积>50%。果皮褐变指数计算如公式(2)所示：

(2)

1.3.2 品质指标的测定

硬度：使用FT-327型硬度计测定果肉硬度，将苹果靠近果体赤道部位对称的两个部位去皮，将直径为1.1 cm的探头刺入苹果果肉深0.8 cm，读数显示果肉硬度值。

失重率：采用果实称重法，每个贮藏库分别隔30 d选取50个果实做好标记，测定结果，测定完放回库中，根据公式(3)计算：

(3)

可溶性固形物(soluble solids content，SSC)：使用PAL-1型数显手持糖度计测定单果赤道两对称面果汁SSC含量。

可滴定酸(titratable acid,TA)：参照GINÉ-BORDONABA等[13]的酸碱指示剂滴定法，测定贮藏期间瑞雪苹果果肉可滴定酸含量变化。

1.3.3 总酚含量和PPO活性的测定

参照高俊凤[14]的Folin-Ciocalteu比色法并稍作修改测定瑞雪苹果果皮总酚含量。

总酚提取：1%(体积分数)盐酸-甲醇溶液中加入适量液氮研磨的果皮粉末，添加70%(体积分数)乙醇溶液，超声45 min，避光浸提24 h，10 000 r/min离心15 min，留上清液。用福林酚法测定样品中的总酚含量，每个样品取3次重复。

果皮PPO的活性参考高俊凤[14]的测定方法并稍作修改，取液氮保护下研磨好的果皮组织混样2 g，添加0.1 mol/L PBS (pH 6)定容至25 mL，然后转移到20 ℃水浴浸提30 min。于4 ℃下将该混合液，经11 180×g离心15 min，取上清液(酶提取液)。反应体系包含4.5 mL PBS、1 mL 0.1 mol/L焦儿茶酚和0.5 mL上清液。将反应混合液置于37 ℃恒温水浴槽中反应15 min，在525 nm下测定吸光度，单位为U/(mg prot·min)。

1.3.4 类黄酮含量的测定

参照陈玮琦等[15]，取研磨后的果皮冻样于1%的盐酸-甲醇溶液中，避光浸提24 h，70 ℃超声波提取60 min，9 000 r/min离心10 min，取上清液用亚硝酸钠-硝酸铝比色法测定果皮类黄酮含量，每个样品取3次重复。

1.3.5 抗氧化酶活力的测定

果皮SOD的活性参考高俊凤[14]的NBT法进行测定，单位为U/(mg prot·min)。使用南京建成生物工程研究所的过氧化氢酶(catalase，CAT)可见光试剂盒测定CAT活性，单位为U/(mg prot·min)。

1.3.6 DPPH清除率的测定

参照陈玮琦等[15]的方法并加以作改进，测定DPPH自由基清除率，向0.5 mL不同浓度梯度的样品甲醇溶液中加入4.5 mL DPPH-甲醇溶液，振荡后静置30 min，室温下于517 nm处测定反应液的吸光度值变化，每个样品重复3次。

1.4 数据处理与分析

所有果实处理和测定的指标均重复3次，采用Graphpad Prism 8软件进行数据统计和作图，SPSS 20.0软件数据分析。

2 结果与分析

2.1 气调贮藏对瑞雪果皮褐变的影响

如图1所示，新采收的瑞雪果面洁净、雪白亮黄色、梗洼处未发生褐变。随着贮藏时间的延长，贮藏至120 d时，冷藏的果实发生了不同程度的褐变，且果面暗黄色，但气调贮藏的果实还未褐变。贮藏至210 d时冷藏的果实褐变面积加大，发病情况加重，但气调贮藏的果实褐变程度较轻，褐变面积小，不明显。从直观结果得出，相比于冷藏，气调贮藏能显著抑制果皮的褐变。

a-0 d;b-120 d;c-210 d

随后，本研究对2种贮藏方式下瑞雪果皮的褐变率和褐变指数进行统计学分析。如图2所示，随着贮藏时间的延长，2种贮藏方式下瑞雪果皮的褐变率和褐变指数均逐渐增加，但气调贮藏的褐变率和褐变指数始终低于冷藏，其中在贮藏60 d后，2种贮藏方式的果皮褐变率、褐变指数差异达到极显著水平(P<0.01)。该结果表明，气调贮藏下瑞雪果皮褐变控制效果更好。

a-果皮褐变率；b-果皮褐变指数

2.2 气调贮藏对瑞雪品质的影响

2.2.1 气调贮藏对瑞雪果实硬度和失重率的影响

贮藏过程中，果实硬度和失重率的变化在很大程度上直观地反映了贮藏效果的好坏，是衡量果实商品性的重要指标。由图3-a可见，随着贮藏时间的延长，2种贮藏方式下瑞雪硬度均呈下降趋势，气调贮藏的瑞雪果实硬度显著高于冷藏(P<0.05)。由图3-b可见，随着贮藏时间的延长果实失重率均不断上升，但在贮藏60～180 d气调贮藏瑞雪失重率显著低于冷藏(P<0.05)。

a-硬度；b-失重率

2.2.2 气调贮藏对瑞雪果实SSC、TA的影响

果实SSC、TA含量影响果实的风味，与果实采后贮藏特性密切相关。由图4-a可见，随着贮藏时间的延长，2种贮藏方式下瑞雪果实的SSC变化呈现先升高后降低的趋势，气调较冷藏提前30 d达到SSC峰值。贮藏期，气调的瑞雪SSC始终显著高于冷藏(P<0.001)。由图4-b可见，在整个贮藏期间，TA呈现下降趋势，气调贮藏果实的TA下降更缓慢，且在60 d后显著高于冷藏(P<0.05)。相比于冷藏，气调贮藏能够延缓瑞雪果实SSC、酸度的降低，较好地保持果实品质。

a-可溶性固形物；b-可滴定酸

2.3 气调贮藏对瑞雪果皮抗氧化能力的影响

2.3.1 气调贮藏对总酚含量及PPO酶活性的影响

果皮总酚含量和PPO酶活性的动态变化，与贮藏过程中果皮的褐变密切相关。如图5-a所示，在整个贮藏期间，总酚含量在2种贮藏方式下的变化趋势基本一致，均为先升高后降低，且在120 d时均达到峰值。整个贮藏期，气调贮藏的果皮总酚含量显著高于冷藏(P<0.05)。如图5-b所示，在整个贮藏期，气调贮藏的PPO活性极显著低于冷藏(P<0.01)。结果表明，气调贮藏显著抑制PPO活性的升高和酚类物质的消耗。

a-总酚；b-PPO活性

2.3.2 气调贮藏对类黄酮含量、DPPH自由基清除率的影响

类黄酮是植物重要的酚类次生代谢物，可以抑制脂类过氧化、清除自由基，是果实品质的重要指标；DPPH自由基清除率是反映果皮的抗氧化能力变化的重要指标。如图6-a所示，贮藏期间，2种贮藏方式下果皮类黄酮含量变化趋势一致，贮藏第1个月降低，之后，随着贮藏时间的延长，果皮类黄酮含量呈现先升高后降低趋势，在120 d达到峰值。在贮藏60～210 d气调贮藏的类黄酮含量显著高于冷藏(P<0.05)。如图6-b所示，2种贮藏方式下，DPPH自由基均随着贮藏时间的延长降低，气调贮藏抑制了DPPH自由基清除率的降低，在60～210 d，气调贮藏显著高于冷藏(P<0.05)。

a-类黄酮；b-DPPH自由基清除率

2.3.3 气调贮藏对抗氧化酶活性的影响

SOD、CAT是果皮中的活性氧清除酶，可以维持果皮活性氧代谢平衡。如图7所示，在整个贮藏期，瑞雪果皮中SOD、CAT活性均呈现先升高后降低的趋势，在120 d达到峰值。如图7-a所示，在整个贮藏期，气调贮藏方式的瑞雪果皮SOD活性均显著高于冷藏(P<0.05)。如图7-b所示，在整个贮藏期，气调贮藏显著抑制CAT活性降低，差异显著(P<0.05)。结果表明，气调贮藏能更好地保持瑞雪的SOD、CAT酶活性，维持其抗氧化能力。

a-SOD；b-CAT

2.4 贮藏期间瑞雪果皮褐变与各个抗氧化指标的相关性

经统计学相关性分析，如表1所示，瑞雪果皮褐变率与类黄酮含量、CAT酶活性呈显著负相关(P<0.05)，与DPPH自由基呈极显著负相关(P<0.01)，与总酚含量、SOD酶活性呈负相关；瑞雪果皮褐变率与PPO酶活性呈显著正相关(P<0.05)。瑞雪果皮褐变指数与DPPH自由基和类黄酮含量呈显著负相关(P<0.05)，与总酚含量、CAT活性、SOD活性呈负相关，同时褐变指数与PPO酶活性呈显著正相关(P<0.05)。结果表明，瑞雪的果皮褐变与抗氧化能力有关系。

表1 瑞雪褐变与生理指标的相关性

3 讨论

本研究对比了冷藏和气调贮藏对套袋瑞雪苹果的保鲜效果。结果表明，气调贮藏能够减缓瑞雪苹果果实硬度、TA、SSC、失重率的降低，减少贮藏损失。这可能是因为，相比冷藏，气调贮藏不仅可以控制贮藏温度还可以严格控制气体成分，进而有效抑制果实的代谢速率，减缓果实的成熟衰老[4]。

本文也对果实褐变的机制进行初步探究。本文结果显示，贮藏60 d以后，气调贮藏较冷藏显著抑制瑞雪苹果的果皮褐变率和褐变指数(P<0.01)，表明气调贮藏更好地维持了瑞雪的商品性，保鲜效果显著提升。这和前人在苹果、梨虎皮病上的研究结果类似，果皮褐变是苹果、梨虎皮病的直观症状，研究发现气调贮藏能显著抑制虎皮病的果皮褐变，在冷藏条件下，大部分苹果、梨的贮藏期约为5个月，但气调贮藏可将贮藏期延长至10个月[16-17]。已有研究表明，大部分果皮褐变是贮藏后期果皮细胞抗氧化系统失衡导致[18]。

SOD、CAT等抗氧化酶通过清除细胞内活性氧，维持细胞氧化平衡，抑制活性氧对果皮细胞膜的攻击，抗氧化物质多酚、类黄酮等具有超强的活性氧清除力，参与抵抗植物胁迫应答，从而减少果皮褐变发生[19-20]。本研究结果显示，整个贮藏期，气调贮藏的瑞雪果皮中总酚含量和SOD、CAT活性均显著高于冷藏(P<0.05)；在贮藏60～210 d，气调贮藏的果皮类黄酮含量和DPPH自由基清除率显著高于冷藏(P<0.05)；整个贮藏期，气调贮藏的果皮PPO活性极显著低于冷藏(P<0.01)。这表明气调贮藏减缓了抗氧化酶活性和抗氧化物质的降低，这和前人在石榴、芒果、苹果上的研究结果类似[21-23]，即气调贮藏的果实抗衰老、防褐变能力更强。此外，本研究分析表明瑞雪苹果果皮褐变率和褐变指数与抗氧化相关指标DPPH自由基、CAT活性、类黄酮含量呈显著负相关(P<0.05)，而与氧化指标PPO活性呈显著正相关(P<0.05)。在果实的成熟衰老过程中，果实抗氧化能力逐渐降低，延缓果实中抗氧化酶活性的降低和抗氧化物质含量的减少则抑制果实衰老，降低果实生理性病害发生的风险。因此，本研究认为气调贮藏能够减缓贮藏期果皮抗氧化酶活性和抗氧化物质的降低，抵御活性氧积累引起的衰老进程，从而抑制瑞雪果皮褐变。

4 结论

相比冷藏，气调贮藏能够更好地维持套袋瑞雪苹果的贮藏品质，减缓套袋瑞雪苹果果皮抗氧化能力降低，同时抑制PPO的活性。本研究得出，套袋瑞雪苹果果皮褐变与果皮抗氧化能力下降密切相关，相比于冷藏，套袋瑞雪苹果更适合气调贮藏。本研究仅初步明确气调贮藏是套袋瑞雪保鲜的较好形式，未对不同气调贮藏条件进行比较，未来可以从气调具体指数着手，寻找最佳的气体成分组合，有效抑制套袋瑞雪的果皮褐变。