外泌体源性非编码RNA在糖尿病视网膜病变中的诊断价值

李梓萌,刘宇龙

(吉林大学中日联谊医院 1.内分泌代谢科;2.骨科,吉林 长春130033)

糖尿病视网膜病变(Diabetic Retinopathy,DR)是糖尿病最常见和严重的并发症,已经成为成人失明和视觉损伤的主要原因[1]。DR早期常常没有任何症状,随着疾病的进展,可以出现不同程度的视力缺失且不可逆转[2]。目前DR尚无早期诊断和治疗方法[3],晚期治疗手段也较少且存在争议[4]。因此,对DR的早筛查、早诊断、早治疗已成为目前临床中亟需解决的问题[3]。外泌体源性非编码RNA(non-coding DNA,ncRNA)近年来被认为有望成为疾病极具潜力的生物标志物[5-6]。目前已有成熟的肝癌、胰腺癌相关miRNA检测试剂盒,但是在DR领域尚无明确研究成果。因此,明确外泌体源性非编码RNA在糖尿病视网膜病变中的诊断价值具有重大意义。

1 糖尿病视网膜病变流行病学及诊断现状

据统计,在全球糖尿病患者中,糖尿病视网膜病变的发生率为22.27%,2020年DR患者约有1.0312亿,预计2045年将达到1.605亿[2]。糖尿病视网膜病变主要分为非增殖期(Non-proliferative Diabetic Retinopathy,NPDR)及增殖期(Proliferative Diabetic Retinopathy,PDR)。早期特点是视网膜上血管内皮细胞和周细胞的进行性丢失以及连接蛋白的缓慢溶解,导致血管渗透性增加和视网膜黄斑水肿;晚期特点是炎症细胞浸润、组织破坏和新生血管形成,进一步引起玻璃体积血及牵拉性视网膜脱离[1]。眼底荧光素血管造影(Fundus fluorescein angiography,FFA)是诊断DR的金标准[2],但其为侵入性检查,此外尚有检眼镜检查、彩色眼底照相和光学相干断层扫描等方法[2],但因无法发现早期病变、容易漏诊细微病变、对医生的诊断水平要求很高等缺点限制了临床应用。近年来的研究表明,在DR的病程进展中,神经退行性病变早于微血管改变[7]。因此,需要更有效的检测手段早期预测或发现糖尿病视网膜病变并进行早期干预。

2 外泌体源性非编码RNA在糖尿病视网膜病变中的诊断价值

2.1 外泌体源性非编码RNA作为生物标志物在疾病诊断中的优势

外泌体是一种细胞外泌性囊泡,可由多种细胞产生并释放入细胞外空间,广泛存在于血液、尿液、唾液等各种生物体液中,富含核酸(miRNA、lncRNA、circRNA、mRNA、tRNA等)、蛋白质、脂质等[8]。外泌体作为细胞间通讯的重要媒介,携带和传递重要的信号分子,广泛参与细胞间物质运输和信息传递,调节细胞生理活动,与多种疾病的发生和发展密切相关[8]。其良好的生物相容性及穿越生物屏障的能力保证了内容物的完整性和活性。ncRNA如lncRNA、miRNA、circRNA等主要参与转录后调控,可以在外泌体的保护下免受体液中RNA酶的降解而稳定存在,随外泌体循环并被邻近或远处的细胞摄取,参与受体细胞的增殖、分化、迁移等活动,调控疾病的发生和进展[5]。lncRNA、circRNA还能充当竞争性内源RNA(ceRNA)或者RNA海绵,通过抑制miRNA活性来调节靶基因表达[9]。疾病发生时,组织中特异性外泌体释放入外周血,致使循环中ncRNA的表达谱发生改变,其变化出现在疾病的早期阶段并可以被高效、定量检测出来,比常规检查具有更高的敏感性和特异性。此外,循环miRNA等在体内可以存活很久(接近2周)[10],并且在体外各种不同的环境下能够稳定存在,可以抵抗不同的pH、温度、气压及核糖核酸酶RNases,甚至可以在反复冻融条件下稳定存在、高效恢复并可以被高效、定量检测出来。因此,近年来外泌体源性ncRNA凭借其稳定性、普遍性、高特异性、高灵敏度,被认为可以成为疾病极具潜力的非侵入性生物标志物[8]。

2.2 外泌体源性非编码RNA作为糖尿病视网膜病变生物标志物的研究现状

糖尿病视网膜病变发生时存在大量异常表达的ncRNA,它们可以选择性地透过血-视网膜屏障[11],影响炎症应答、胰岛素信号通路和血管生成[12],与视网膜细胞的增殖、迁移、凋亡有很重要的关系[10]。外泌体源性ncRNA可以转移到靶细胞或靶器官调节基因表达,也可以在其囊泡结构保护下稳定储存在循环液中,因此,它们可以作为反映疾病进展的生物标志物[6]。大量研究表明外泌体源性ncRNA有望成为DR早期诊断的生物标志物及治疗靶点[8],如miR-202-5p、miR-15a、miR-20a-5p、miR-20a-3p、circ-Ehmt1、circ-0005015、lncRNA SNHG7等。但是目前国内外非编码RNA与DR的相关研究中,以细胞、动物研究居多,临床研究较少且多采用qRT-PCR或基因芯片进行候选验证,无法寻找最有意义的ncRNA分子,仅有少数研究采用高通量测序进行全基因组筛选但样本数极少(仅为个位数)。

2.2.1外泌体源性miRNA作为糖尿病视网膜病变生物标志物的研究现状 miRNA是内源性非编码单链小分子RNA,长度约为19～24个核苷酸[2],在人类所有类型细胞中都有表达,参与了机体几乎所有的病理生理过程,如细胞增殖、分化、凋亡等[6]。外泌体源性miRNA进入靶细胞后,可直接与特定靶mRNA的3’-非翻译区(3’-untranslated region,3’-UTR)相结合,通过降解靶mRNA或抑制其翻译,在转录后水平调控基因蛋白质的表达。外泌体源性miRNA也可以与lncRNA等“海绵”结合,发挥生理调节作用[6]。近来研究报道了外泌体源性miRNA在DR发展中的重要作用,特别是在视网膜细胞功能障碍中[6]。如KAMELDEN等证明[13]胰腺β细胞来源的外泌体源性miR-15a可以进入血液并通过靶向AKT3促进视网膜Müller细胞的凋亡,MAISTO[14]等报道高糖水平可以降低原代视网膜细胞释放的外泌体中抗血管生成的miRNA(如miR-106a-5p、miR-20a-5p和miR-20a-3p)的水平,以调节VEGF的表达,从而促进视网膜光感受器的损伤。目前许多临床研究发现DR患者血清中外泌体源性miRNA显著升高,可作为DR诊断的生物标志物,具有较高的诊断效力,不仅可以用来诊断DR,还可以区分增殖期与非增殖期。如LIU等[15]通过qRT-PCR及ROC曲线发现与与健康对照组相比miR-425p诊断DR的AUC值为0.907 2,敏感度91.7%,特异度84%,与2型糖尿病患者相比其诊断的AUC值为0.833,敏感度85.7%,特异度78%;用来区别增殖期和非增殖期的AUC值为0.802,敏感度94.5%,特异度71.1%。WANG等[16]通过qRT-PCR及ROC曲线发现miR-374a用来诊断DR的AUC值为0.892,敏感度为82.9%,特异度为80.29%,用来区别增殖期和非增殖期的AUC值为0.807,敏感度为84.2%,特异度为78.83%。

2.2.2外泌体源性lncRNA作为糖尿病视网膜病变生物标志物的研究现状 长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是转录本长度大于200nt的非编码RNA[17]。在表观遗传、转录和翻译水平上调控基因表达和蛋白质形成,并影响细胞增殖、凋亡、免疫反应和氧化应激[17]。近来研究表明,lncRNA MALAT1、lncRNA MEG3、lncRNA MIAT、lncRNA H19、lncRNA HOTAIR、lncRNA BANCR、lncRNA SNHG16等可通过PI3K-Akt、SIRT1、P38 MAPK、TGF-β、Nrf2等通路参与DR的进展[17]。研究表明lncRNA MALAT1在DR神经变性、炎性反应、血管新生方面发挥了一定的致病作用[9,18-19],DR患者血清中MALAT1表达上调,可作为DR早期诊断及严重程度的无创生物标志物[20],MALAT1下调将明显改善糖尿病视网膜周细胞丢失、毛细血管变形、微血管渗漏、炎症及视网膜光感受器损害所致的糖尿病神经变性[21,17],减轻氧化应激损伤,延缓DR的病程进展[22]。lncRNA PPT2-EGFL8在DR患者外周血中表达明显下降,miR-423-5p明显上升,PPT2-EGFL8通过分子海绵作用吸收miR-423-5p,抑制缺氧诱导的人视网膜微血管内皮细胞增殖[23]。血浆外泌体lncRNA DLX6-AS1和PRINS二者联合诊断DR的AUC值为0.813,有望作为DR的诊断标志物[24]。BISWAS等在患者血清中检测了9个lncRNAs(ANRIL、MALAT1、WISPER、ZFAS1、H19、HOTAIR、HULC、MEG3和MIAT),通过ROC和进一步分析,确定了lncRNA联合应用可以用来诊断筛查DR患者[25]。

2.2.3外泌体源性circRNA作为糖尿病视网膜病变生物标志物的研究现状

与传统的线性RNA不同,circRNA是一种特殊类型的非编码RNA,其分子呈封闭环状结构,不受RNA外切酶影响,表达更为稳定[26]。circRNA已成为继miRNA和lncRNA之后,ncRNA研究领域的新热点,可以通过影响RNA聚合酶链长度、作为miRNA海绵调节靶基因表达、与RNA结合蛋白相互作用调节翻译过程等方式调节各种细胞活动[27]。越来越多研究表明circRNA如circHIPK3、circRNA cZNF609等可通过调节视网膜血管内皮细胞的生长、增殖、迁移等在DR疾病进程中发挥重要作用[27]。有研究通过芯片发现糖尿病视网膜组织中529个circRNA异常表达,通过qRT-PCR验证了DR患者外周血中circ_0005015高表达,可作为DR诊断的生物标志物,其可通过调节内皮细胞增殖、迁移等调控视网膜内皮血管生成,可作为miR-519d-3p海绵抑制其表达并增加MMP-2、XIAP、STAT3的表达[28];有研究通过测序和qRT-PCR发现hsa_circ_0001953在PDR患者中明显升高,ROC曲线显示其与NPDR患者和对照组相比有较高诊断准确率,AUC值分别为0.87和0.92[29]。最新有研究通过对患者血清外泌体中分离的总RNA进行测序发现circMKLN1在DR中异常高表达,在链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病小鼠模型中通过AAV2转导抑制cricMKLN1可显著改善视网膜血管渗漏,在人视网膜内皮细胞(hRECs)中发现circMKLN1可作为分子海绵吸附miR-26-5p,调节高糖/甲基乙二醛介导的自噬[30]。

3 总结与展望

综上所述,需要通过更多临床研究发现最有诊断价值的外泌体源性ncRNA,并通过细胞、动物研究解析ncRNA在DR发生发展中的重要作用,以期将外泌体源性ncRNA作为DR早期诊断的生物标志物,达到对疾病的预防、早筛及早干预,为临床上DR的早期诊断及治疗提供一定的帮助。