硫化氢在细菌中的代谢和功能以及与结核分枝杆菌的相互作用

王 睿

(约克大学 理学院生物学系,多伦多 安大略 M3J 1P3,加拿大)

结核病(tuberculosis,TB)是由结核分枝杆菌引起的一种传染病,目前仍影响着全球数百万人的健康。贵州省卫生健康委员会于2021年颁布的《贵州省遏制耐药结核病推进方案》中指出,中国是全球肺结核病高发国家之一,其中贵州省是中国的肺结核病高发地区之一。近年来,由于“健康贵州”行动和重大疾病防控专项行动的实施,贵州省的结核病防控取得了明显成效。2021年贵州省报告的肺结核发病率为85.40/10万,较2012年下降了34.95%。然而,关于肺结核的防控,尤其是对耐多药肺结核的防治效果并不理想,仍是当前所面临的重大公共卫生问题。更好地了解耐多药结核病的发病机制,寻求新的有效的干预策略是当务之需。

在过去的二十余年里,生物医学研究已经明确了硫化氢(hydrogen sulfide, H2S)在调节细菌和宿主(真核细胞)细胞新陈代谢和功能方面的作用。最近研究阐明了H2S在结核分枝杆菌(mycobacteriumtuberculosis,MTB)中的产生、代谢以及对结核病发病和传播的影响。本综述将首先介绍真核细胞及细菌产生和代谢H2S的过程;然后详述H2S对MTB存活和生长的影响以及H2S与MTB中特定蛋白质相互作用的分子机制;最后指出基于干扰H2S的策略在治疗结核病方面的应用前景,为结核病的防治提供新的思路。

1 哺乳动物细胞中硫化氢的代谢和功能

在传统认识上,硫化氢被视为一种存在于污染环境中的有毒气体[1]。然而,在过去的二十余年里,人们逐渐认识到内源性硫化氢具有重要的生理意义[2-3]。在逆转硫脲合成途径中存在两个关键酶,分别为半胱氨酸-β-合成酶(cystathionine beta-synthase, CBS)和半胱氨酸-γ-裂解酶(cystathionine-γ-lyase, CSE)。以同型半胱氨酸和/或L-半胱氨酸作为底物产生硫化氢、丙酮酸和氨[1, 4-5]。CBS和CSE均以磷酸吡哆醛(pyridoxal phosphate, PLP)作为辅助因子。人类CBS是四聚体结构,通过结合到蛋白质C端末端的保守结构域而产生变构刺激。CBS还是1种含有血红素的蛋白质,能与一氧化氮(nitric oxide, NO)和一氧化碳(carbon monoxide, CO)发生反应。CBS可将L-半胱氨酸水解成H2S和L-丝氨酸;还可从L-同型半胱氨酸中产生L-半胱氨酸。CSE是一种同型四聚体结构,在催化L-半胱氨酸和L-同型半胱氨酸产生硫化氢的过程中,同时产生了氨和丙酮等副产物。

除CBS和CSE外,参与H2S产生的第三个酶是不依赖PLP的3-硫巯丙酮硫转移酶(3-mercaptopyruvate sulfur transferase, 3-MST)。MST广泛分布于原核生物和某些类型的真核生物中。MST经过两个步骤产生H2S。首先,在半胱氨酸氨基转移酶(cysteine aminotransferas, CAT)的存在下,L-半胱氨酸和α-酮戊二酸发生反应,产生3-硫巯丙酮和L-谷氨酸。随后,MST导致3-硫巯丙酮的脱硫作用,并将硫转移给活性位点上的亲核性半胱氨酸,形成一个硫氧酮结合物。在还原条件或存在硫氧还蛋白等受体的情况下,H2S会被释放出来,MST和CAT则存在于细胞浆和线粒体中。CBS是中枢神经系统中产生H2S的主要酶,在神经元和星形胶质细胞中表达。CBS在海马和小脑部位高度表达,而在大脑皮层和脑干表达较少。在心血管系统、呼吸系统、睾丸、脾脏和胰腺组织中,CBS表达很少,几乎不表达[6],但这些组织中CSE表达丰富[1, 7]。CSE在大脑的表达具有区域性,在皮层、纹状体、小脑、脑干、海马和下丘脑等组织中表达。在心血管系统中,内皮细胞和其他类型的细胞中可检测到MST,但在血管平滑肌细胞或心肌细胞中不存在。MST也在肝脏和肾脏中表达。在中枢神经系统中,MST定位在海马锥体神经元、小脑的普尔金耶细胞以及大脑嗅球中的嗅球细胞[8]。

通过单溴苯胺法联用RP-HPLC方法或测量顶空H2S气体等方法检测小鼠或人类血液中的内源性H2S水平为0.2～0.8 μmol/L,Acid-labile硫水平为1.8～3.8 μmol/L。这些检测方法获得的数值与之前报道的通过改良的气相色谱/质谱技术检测定的猪和小鼠血液中H2S水平(0.5～2.5 μmol/L)基本一致[9]。这些研究结果均支持血浆中H2S的生理水平维持在较低μmol/L到较高nmol/L范围内的观点[10-12]。尽管H2S在组织中预期的生理浓度可能是血液的10倍,但组织中H2S的具体生理浓度尚不清楚[13]。有趣的是,游离的H2S在血管组织中,如H2S在主动脉中的水平可能是其他组织中的20～100倍[14]。生理浓度的H2S在组织细胞中的重要作用已经被揭示和证实。加拿大王睿团队首次在血管组织中克隆并测序了CSE[3],并进一步证明外源性和内源性H2S通过刺激KATP通道以舒张血管,从而降低血压[3, 15-16]。H2S抑制血管平滑肌细胞的增殖[6, 17],但刺激血管内皮细胞的增殖[18-19]。

世界上第一个CSE基因敲除模式小鼠(CSE-KO)于2008年建立。该模式小鼠由于内源性H2S水平降低而出现年龄依赖性高血压[7],这项具有里程碑意义的研究首次为世界提供了内源性H2S生理功能的直接证据。血管内皮源性超极化因子(endothelium-derived hyperpolarizing fact, EDHF)的分子身份长期以来一直困扰着科学界。加拿大王睿团队证明了H2S是血管内皮起源的舒张因子(endothelial-derived relaxing factor, EDRF)[7],而且还首次提出H2S很可能就是EDHF[20-22]。H2S抑制动脉粥样硬化的早期发展[23],在保护心脏免受缺血再灌注损伤方面发挥重要作用[24-26]。此外,H2S还具有抗炎和抗氧化的作用[1, 3, 7]。但内源性H2S超出生理范围后可产生有害反应。例如,过高水平的内源性H2S增强了低氧引发的大鼠肺血管收缩[27]。胰岛β细胞中的H2S生成主要由CSE催化,它可以被葡萄糖抑制。Wu等[28-30]系列研究证明,过量产生的H2S刺激β细胞中的KATP通道并阻断钙通道,导致胰岛素释放受到抑制。这些发现证实了H2S是胰岛素释放的内源性抑制因子,从而填补了胰岛素释放调节机制的重要缺漏,同时也建立了一个可能的新的糖尿病分型——硫化氢过量产生型。H2S还通过降低肝脏中的葡萄糖激酶活性来降低葡萄糖摄取和糖原储存,并刺激肝脏生成葡萄糖[31]。此外,H2S的异常代谢与哮喘的发病机制有关。内源性H2S产生过低可能会增强Ⅱ型免疫反应,并在幼年时导致过敏性哮喘的高发生率。因此,基于上述理论基础,干扰H2S的策略可用于预防和治疗哮喘[32-33]。

真核细胞中氧传感的分子机制可能与H2S代谢有关。在哺乳动物的血管平滑肌细胞中,当钙水平升高或氧水平下降时,CSE可从细胞浆转运至线粒体内并在线粒体中产生H2S。因此,在缺氧条件下,H2S可以增加ATP产量[34]。肝细胞线粒体中存在着CBS,缺血/缺氧会促进CBS在线粒体内的积累和H2S生成,原因是氧敏感性Lon蛋白酶的失活[35]。H2S通过使ATP合成酶发生巯基化,从而刺激线粒体的ATP产生[36]。因此,H2S在细胞中起到了氧气传感器和能量代谢调节的作用。近年来H2S生物医学研究的另一个重大突破是发现了节食带来的长寿和血管新生作用的分子机制是通过H2S对生物能量代谢的调节而实现的[37-38]。迄今为止,最为广泛接受的硫化氢作用的分子机制是H2S通过S-巯基化直接修饰各种蛋白质的半胱氨酸残基[18,39]。这种翻译后修饰表现为硫化物与半胱氨酸残基(巯基或-SH)的共价结合,形成水合硫代硫醇(-SSH)。H2S还可通过作用于含金属辅基的金属蛋白发挥细胞效应。这些金属蛋白包括血红素蛋白、金属酶和铜蛋白等。一些含铁硫簇的金属蛋白在线粒体的电子传递氧化还原反应中发挥着重要作用,例如电子传递复合物Ⅰ、复合物Ⅱ和辅酶Q-细胞色素c还原酶。H2S还与电子转移反应中的金属进行相互作用。该反应发生在各类硫化物和金属之间。此外,H2S与金属配体结合对于形成配位复合物是非常重要的。在哺乳动物细胞、植物和细菌中,H2S与重金属(如汞)的相互作用产生抗重金属毒性的多种保护效应。

2 细菌中硫化氢的产生

微生物群是某一特定环境中细菌、病毒和真菌的集合体。在生理条件下,它们定植在胃肠道、皮肤、口腔和其他直接与体表相连的器官。来自500～1 000种微生物群的1 014种内源和外源微生物寄居在哺乳动物体内。微生物群产生各种代谢产物用于自身利用以及支持和调节宿主代谢。在人类胃肠道中,微生物群是H2S的最主要来源。由细菌产生的H2S构成了与抗生素和氧化应激相关的交织防御系统,对自身起到保护作用,但对宿主起到有害作用。H2S作为宿主上皮细胞在缺氧环境中的替代ATP提供者[40]。由细菌产生的H2S还可以刺激宿主胃肠道上皮细胞的增殖,影响黏膜防御和修复。

通过转硫酰化途径,细菌利用CSE、CBS和MST的部分或全部同源酶产生H2S。细菌使用含硫氨基酸(L-半胱氨酸和甲硫氨酸)作为H2S产生的底物。对于大多数细菌来说,L-半胱氨酸是通过CysE、CysK和CysM酶催化从L-丝氨酸产生[41]。与甲硫氨酸代谢相关的主要细菌有梭状芽孢杆菌属、肠球菌属、厚壁菌属、沙门氏菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌和脱硫弧菌属,它们主要寄居于人类大肠。非酶催化途径也对细菌内源性H2S水平作出贡献。这些途径包括半胱氨酸和其他含硫氨基酸/肽的降解以及硫酸盐还原细菌(sulfate-reducing bacteria, SRB)对无机硫化合物的非耦合还原。人体肠道寄生的SRB包括脱硫弧菌、脱硫杆菌、脱硫 古菌和脱硫钙菌。作为地球上最古老的微生物群之一[42],SRB代表了正常肠道微生物群的一个主要类群。一项调查研究显示,在美国约有50%的健康个体肠道被SRB寄生,其中δ变形菌门的成员脱硫弧菌是主要的H2S产生者[43],细菌还可以产生多硫硫化物[44]。

3 硫化氢对肠道细菌的影响

结肠内的肠道微生物群形成线状生物膜,这促进了细菌与胃肠黏膜的和谐共存。具有适当种群比例和微生物群落的生物膜成为防止外来微生物(包括过敏原或致病菌)侵入的保护屏障。生物膜还为微生物群提供了一个生存和繁衍的微环境。微生物群落失调和屏障功能受损是炎症性肠病最突出的特征之一。当黏膜发生炎症时,黏液的产生减少,微生物生物膜的完整性被破坏。肠道细菌可以生活在两种不同的群落中。游离态的细菌在肠道腔内独立生活,并在这种环境下萌发、繁殖并产生细菌毒素。而在固着态中,同一种细菌形成生物膜,有助于保护宿主肠道上皮的完整性。游离态和固着态的细菌对抗生素的耐受性不同[45]。

Motta等[46]进行了一项硫化氢对人体微生物生物膜影响的研究,将来自健康志愿者离体结肠活检的微生物生物膜在厌氧条件下暴露于硫化氢供体中,持续24 h。结果发现NaHS(硫氢化钠)和二烯丙基二硫醚(diallyldisulfide, DADS,一种缓慢释放硫化氢的供体)促进了微生物生物膜中固着态细菌的生物量和代谢活性[46]。将硫化氢供体注入C57Bl/6小鼠和Wistar大鼠的结肠中,则有利于修复2,4-二硝基苯磺酸(2,4 -dinitrobenzene sulfonic acid, DNBS)诱导的结肠炎,并增加黏液的产生,恢复正常的微生物生物膜结构,在生物膜修复过程中,同时减少了游离态细菌的生长[46]。CSE-KO小鼠的结肠组织产生的内源性硫化氢显著减少,并且结肠中有轻度的粒细胞浸润[46]。另一项研究显示,给予大鼠硫化氢供体后,大鼠微生物群落发生了显著变化,纠正了长期使用非甾体类抗炎药引起的菌群紊乱[47]。内源性硫化氢有助于结肠黏液层厚度的增加,抑制小鼠的CSE会加重炎症并改变结肠微生物的生物膜。在DNBS诱导的结肠炎大鼠模型中,DADS治疗可减少中性粒细胞浸润,恢复微生物生物膜,增加黏液颗粒的产生。硫化氢表现出对于人类肠道内的游离态细菌的显著抗菌活性[46]。对固着态细菌的保护和对游离态细菌的杀菌效果表明宿主产生的硫化氢在矫正微生物生物膜紊乱和重建黏液层中起着重要的作用。

硫化氢与细菌之间的相互作用也可从硫化氢对巨噬细胞的影响窥见一斑。巨噬细胞产生多种抗微生物分子,包括一氧化氮(NO)、过氧化氢和酸(H+)。通过这些产物,巨噬细胞可以消灭吞噬细菌。这些抗微生物分子的产生受到巨噬细胞产生的硫化氢的调控。在脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)刺激下,巨噬细胞上调CSE mRNA和蛋白的表达,增加H2S、NO和促炎细胞因子的产生[48]。通过使用小分子干扰RNA敲减LPS活化的巨噬细胞中的CSE表达可降低促炎细胞因子的水平,增加抗微生物的NO水平。该研究表明,H2S通过抑制巨噬细胞的活化和NO的产生,保护了被巨噬细胞吞噬的细菌。

4 硫化氢介导细菌的多重耐药性

细菌产生的H2S是许多革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌(包括炭疽芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌等)的抗生素耐药性和氧化应激抗性的分子基础。从尿路感染患者的尿液标本中分离出耐多药的大肠杆菌菌株的同时,其内源性H2S的产生增加,这些耐药细菌对抗生素和氧化应激产生了抵抗性。与野生型菌株相比,MST、CBS或CSE缺陷的菌株表现出内源性H2S产生减少。MST过表达的细菌具有抗链霉素的自我保护能力。另一方面,通过药理学方法抑制MST、CBS和CSE的活性使该细菌对一系列抗生素变得敏感,即使用了低浓度外源性硫化氢盐NaHS,这些病原体仍可对抗生素产生抵抗性[49]。

抗生素(如链霉素、庆大霉素、阿米卡星和氨苄青霉素)会刺激细菌呼吸并通过Fe2+催化的芬顿反应增加羟基自由基的产生,从而对细菌DNA产生氧化损伤。H2S通过它的抗氧化效应来增强细菌对抗生素和氧化应激的抵抗性。比如直接清除Fe2+和抑制相关的抗生素诱导的氧化损伤。H2S可以上调抗氧化酶,如过氧化氢酶和超氧化物歧化酶,加速H2O2的降解,这种效应也可能有助于细菌自我保护免受活性氧自由基的损害。

5 硫化氢在结核病发病机制中的作用

结核病是MTB引起的慢性传染病。据报道,内源性NO和CO可以抑制结核病的进展[50]。相反,外源应用和内源产生的H2S促进结核分枝杆菌的呼吸、生物能量代谢、生长以及结核病的发病过程[51-52]。利用结核分枝杆菌感染CBS缺陷小鼠的模型证实了CBS产生的H2S在结核病中的作用。与野生型小鼠相比,CBS缺陷的感染小鼠存活时间更长,并且结核分枝杆菌在器官中的负载量减少[52]。也有研究发现,通过药物抑制CBS后,小鼠体内结核分枝杆菌的载菌量减少[52]。高分辨率呼吸测定、转录组学和质谱分析也证实了H2S刺激结核分枝杆菌的呼吸和生物能量代谢[52]。

CSE产生的H2S也通过调节免疫应答促进结核病的发展。Rahman等[53]研究发现,感染结核分枝杆菌的CSE-KO小鼠的肺、脾脏和肝脏中细菌负载量较低,并且结核病病理变化较轻,小鼠存活时间比野生型小鼠明显延长。这些结果在细胞研究中也得到了确认。CSE缺陷的巨噬细胞在体外感染MTB后形成的菌落数比野生型巨噬细胞感染MTB后的菌落数量要低。缓慢释放硫化氢剂GYY3147提高了感染结核分枝杆菌的巨噬细胞的存活量,但CSE抑制剂DL-丙炔基甘氨酸则降低细胞存活量。CSE和H2S触发过度的先天免疫反应,抑制适应性免疫反应,降低了感染结核分枝杆菌后宿主的IL-1、IL-6、TNF和IFN水平。硫化氢还抑制了感染结核分枝杆菌的巨噬细胞中的糖酵解通路和糖磷酸戊糖途径。更重要的是,病理变化为坏死性、非坏死性和空洞性肺结核患者病变部位中产生H2S的酶的空间分布显示,过量硫化氢是在结核分枝杆菌感染部位产生的。一方面,结核分枝杆菌利用宿主产生的H2S(由CBS或CSE活化产生)改变免疫代谢引发的结核病发病。另一方面,通过增强对细胞内结核分枝杆菌的清除,H2S可能限制结核分枝杆菌在宿主细胞内的生长[54]。H2S的细胞保护作用是通过激活脱乙酰酶(sirtuin 1,SIRT1)和增加自噬通路的通路共同实现的。Iqbal等[54]在RAW 264.7巨噬细胞、人胚肾(HEK)293T细胞和小鼠胚胎成纤维细胞上发现H2S使糖酵解酶即甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)的活性位点半胱氨酸硫化,导致其重新分布到细胞核中,这是H2S介导的自噬激活的关键步骤。通过该作用机制,H2S刺激自噬介导的结核分枝杆菌进入溶酶体的转运,限制了细胞内结核分枝杆菌的生长。

H2S对结核分枝杆菌的促进作用与H2S诱导的结核分枝杆菌关键酶S-巯基化有关,如含有一个半胱氨酸的过氧化氢酶。结核分枝杆菌中的烷基过氧化物还原酶E( MtAhpE-SH)就是该过氧化氢酶,它与过氧化氢反应形成稳定的硫酸基(MtAhpE-SOH)。MtAhpE-SOH与H2S反应形成可被质谱检测到的硫代硫酸盐(MtAhpE-SSH)。从动力学角度考虑,硫化氢能够完成MtAhpE的催化循环,并可成为结核分枝杆菌代谢的一种替代底物。据文献报道,MtAhpE-SSH可以将硫酸氮硫转移给低分子量巯基,这暗示着含一个半胱氨酸的过氧化氢酶参与了结核分枝杆菌中的跨硫酸化反应[55]。 “transpersulfidation”过程指的是硫化物(sulfane sulfur)从一个分子转移给另一个分子的过程。

H2S还可直接MTB结合。MTB作为细胞内病原体,在感染的宿主细胞中面临着严酷的细胞内环境,包括缺氧以及由免疫细胞产生的各种内源性物质。MTB通过DosS和DosT等血红素感应激酶感知细胞内信号,诱导一组MTB Dos休眠调控子的表达。Sevalkar等[56]在2022年使用紫外-可见光谱和电子顺磁共振光谱技术发现H2S与DosT(Fe2+-O2)没有相互作用。但H2S可直接与DosS的三价铁(Fe3+)血红素结合,而不是与二价铁(Fe2+)血红素结合。这种硫化物结合会缓慢还原DosS血红素铁至二价铁形态。由Steered Molecular Dynamics模拟显示,H2S(不是带电荷的HS-)可以进入DosS血红素口袋。此外,H2S还增加了DosS的自体激酶活性和随后的DosR磷酸化,当缺乏DosS时,MTB中的H2S介导的Dos调控子基因表达增加则失去作用。体外研究显示巨噬细胞中生理水平的H2S通过DosS而诱导DosR调控子基因的表达。

CBS(Rv1077)、CSE(Rv1079)和MST(Rv2291)的潜在同源酶在结核分枝杆菌(MTB)上均有表达。对MTB转硫酸化途径的生化研究揭示Rv1079是一种双功能酶,具有CSE活性和γ-谷氨酰基半胱氨酸合成酶(glutathion cysteine ligase,GCS)的活性[57]。耐多药结核病与MTB产生的硫化氢具有内在联系。耻垢分枝杆菌(mycobacteriumsmegmatis)为一种需氧芽孢杆菌。除一些非常罕见情况外,mycobacteriumsmegmatis并不是一种致病菌。mycobacteriumsmegmatis在实验室研究中经常被用作结核分枝杆菌的模型菌种。它具有生长速度快,易于培养和操作,没有病原性等优势,并且在遗传学研究中相对容易进行基因操纵。MTB-metC(Rv3340)是MTB中参与甲硫氨酸生物合成的酶。在mycobacteriumsmegmatis中过表达Rv3340(Ms_Rv3340)可产生H2S,从而使Ms_Rv3340对链霉素产生耐药性。而抑制H2S产生则导致链霉素对Ms_Rv3340具有杀伤性。Ms_Rv3340降低3个链霉素应答基因的表达水平。该研究首次掲示MTB-metC(Rv3340)产生的H2S导致细菌对链霉素产生耐药性[58]。

6 展望

总体而言,气态递质(NO/CO/H2S)对哺乳动物细胞和系统的影响相似。然而,在结核分枝杆菌的生存和生长方面,H2S与NO和CO的作用相反。H2S的独特作用为探索结核病发展机制、开发新的更敏感的结核病生物标志物以及相应的干预策略提供了新的视角。通过抑制宿主细胞中CBS和或CSE的表达和功能而降低宿主体内MTB的载菌量,这种方法是否可以用于结核病的治疗值得进一步研究。通过抑制MTB-metC来降低MTB产生的H2S水平也很值得探索。另外,调节结核病中紊乱的糖酵解途径也可对抗MTB感染后产生过量的H2S。然而,对于H2S和MTB相互作用的细胞和动物研究仍需进一步加强以便于更深入地了解这些研究的临床相关性和有关诊疗方法的可适度、安全性和特异性。