工程化外泌体在肝癌治疗中的研究进展

赵飞，李刚

海军军医大学第一附属医院 肝胆胰脾外科，上海 200433

肝癌是全球癌症相关死亡的第三大原因，患者5年生存率约为18%[1]。手术切除仍然是治疗肝癌的标准方式[2]。由于转移早、进展快，患者在诊断时多为晚期而失去了手术的机会[3-5]。因此，迫切需要找到一种高效安全的替代疗法来治疗肝癌。

在过去的几十年中，学者们对多种药物递送载体进行了实验研究，例如脂质体、合成纳米颗粒等，且在包括肝癌在内的许多癌症治疗中取得了进展[6]。然而，由于细胞毒性和血脑屏障等原因，此类递送载体的应用受到限制。同时，天然药物递送载体领域发展迅速，例如外泌体。外泌体是从活细胞释放到细胞外微环境的30～150 nm大小的纳米级囊泡[7]，既能传递miRNA和蛋白质等生物活性物质，又能介导细胞之间的通讯[8]，具有治疗肝癌的潜力。外泌体载体综合了细胞药物递送和纳米技术的优势。与细胞疗法相比，外泌体更容易储存，并且安全性更高[9]；与纳米颗粒相比，外泌体是自身细胞分泌的纳米大小的囊泡，具有较低的毒性和较好的生物相容性[10-11]。然而，天然外泌体靶向性差，大部分进入体内后，很容易被循环免疫系统快速清除或被非靶细胞吸收[12]，导致外泌体药物的半衰期缩短。利用生物工程技术对外泌体进行改造，通过加载靶向肽和外源性分子等，提高外泌体的靶向性和稳定性，通过功能装载使其具备治疗的潜力。在本综述中，我们总结了修饰工程化外泌体的不同策略，包括表面修饰和功能装载，以及工程化外泌体在肝癌治疗中的研究进展。

1 工程化外泌体的设计策略

外泌体是细胞间通讯的重要参与者，可以反映亲本细胞的生理和病理状态的改变，它被证实在体液中稳定存在，且能够反映肿瘤的进展。因此，分析循环外泌体及其衍生物可能为癌症液体活检提供新的方法[13]。外泌体已经在一些癌症中展现出作为诊断和预后生物标志物的潜力[14-15]。近年来，外泌体作为载体在药物递送方面也展现出良好的应用前景。利用生物工程对外泌体进行改造修饰，从而实现治疗的目的。目前，制备工程化外泌体主要包括表面修饰和功能装载。表面修饰通过对供体细胞或外泌体进行修饰，可以提高外泌体的靶向性和稳定性；功能装载通过负载一种或多种具有治疗作用的药物和核酸等，实现对肿瘤组织的杀伤作用。

1.1 表面修饰

外泌体表面修饰有利于靶向运输和增加稳定性，表面修饰主要包括基因工程和化学修饰[16-17]。

基因工程是将靶向配体与选定的外泌体膜蛋白相融合，配体蛋白在供体细胞中过表达，继而产生携带靶向配体的工程化外泌体。跨膜蛋白是外泌体膜的一部分，其中包括溶酶体相关膜蛋白2（Lamp-2b）和CD63等，可以通过与靶向配体融合增强外泌体的靶向特异性[18]。将间充质干细胞结合肽E7与外泌体膜蛋白Lamp 2b融合，形成具有靶向特异性的外泌体，相较于没有E7的外泌体能诱导更高程度的软骨分化[19]。CD63是另一种常用的与靶向配体相融合的外泌体膜蛋白。有研究通过将靶向配体Apo-A1与外泌体膜上的CD63相融合，经过基因工程修饰的外泌体可以特异性靶向肝癌细胞，从而抑制肝癌在体外的增殖和迁移[20]。但基因工程操作复杂，并且容易影响原有膜蛋白的生物活性。

除基因工程外，化学修饰也是一种常用的表面修饰技术。化学修饰是通过共价偶联和非共价偶联的方法将靶向配体偶联到外泌体膜上，其中以共价偶联方法更为常用。点击化学作为一种重要的共价反应已被广泛用于外泌体的修饰[21]。基于该策略，有研究通过点击化学将外泌体膜与神经皮素-1靶向肽（RGE）偶联，获得具有特异靶向神经胶质瘤细胞的外泌体[22]。点击化学反应高效，它们可以在较短的时间内快速反应，但由于点击化学反应缺乏特异性，可能会影响外泌体膜上其他膜蛋白的功能。因此，需要精确控制点击化学的反应条件。另外，有研究通过共价偶联外泌体膜蛋白的方法，将细胞穿透肽（CPPs）与肝癌细胞来源的外泌体相结合，增强了细胞内的靶向递送[23]。非共价修饰包括多价的静电相互作用、配体-受体相互作用、疏水作用、基于核酸适配体的表面修饰和CP05肽锚定修饰，研究相对较少，仍需要进一步积极探索[24]。

1.2 功能装载

作为药物递送载体，外泌体可以递送亲水性、亲油性和两亲性的物质[25]。目前，根据工程化对象的不同，外泌体的装载策略可分为内源性装载和外源性装载。

内源性装载是基于亲本细胞的工程化装载方式，首先对外泌体供体细胞进行工程化修饰，通过转染和共孵育等方法将药物导入供体细胞，供体细胞再将药物装载到分泌的外泌体中，从而获得含有药物的工程化外泌体。内源性装载只对供体细胞进行改造和修饰，而对分泌的外泌体不做处理，因此较好地保证了外泌体的完整性和生物学功能[26]。

外源性装载是在分离好的外泌体中，直接将药物装载到外泌体的一种方法，主要应用于一些小的核酸和治疗药物的装载。相较于内源性装载，外源性装载操作更加简单，装载效率也更高，但在装载药物的过程中可能会破坏外泌体的完整性，且需要额外的纯化步骤去除没有装载的药物。外源性装载是目前最常用的外泌体装载策略，主要包括电穿孔、超声、挤压和孵育等[27]。

2 工程化外泌体在肝癌治疗中的应用

外泌体是细胞分泌的纳米级囊泡，由于其免疫原性低、生物相容性好以及可修饰性，成为药物递送的理想载体[28]。基于目前的研究，工程化外泌体用于恶性肿瘤治疗主要有两方面。一方面外泌体可以通过生物工程负载化学药物、核酸等靶向到肝癌细胞中，通过改变肿瘤微环境来抑制肿瘤增殖和杀灭肿瘤细胞；另一方面外泌体可以作为治疗性肿瘤疫苗，引发有效的抗肿瘤免疫反应。

2.1 工程化外泌体靶向递送药物

外泌体由于其组织相容性好且可以负载化学药物或治疗性小RNA，有望成为新兴的治疗恶性肿瘤的方法。工程化外泌体已经在许多癌症研究中取得了良好的进展，相较于传统的治疗方式，工程化外泌体显示出精确高效、低毒的特性。

2.1.1 工程化外泌体负载化学药物用于肝癌的治疗 化学药物的许多靶点都在细胞内，因此化学药物需要穿过细胞膜才能发挥作用，由于水溶性差或过早的降解，化学药物难以发挥预期的作用。作为理想递药载体的外泌体可以高效安全地递送药物，通过减少副作用从而改善预后[29]。Wang等[30]通过将青藤碱（SIN）负载在外泌体中，观察到与游离SIN相比，负载在外泌体中的SIN在肝癌细胞中表现出更强的抑制作用。外泌体可以来源于不同的细胞，不同细胞分泌的外泌体有自己独特的功能。Liang等[31]通过将化学药物去甲斑蝥素（NCTD）包封在骨髓间充质干细胞来源的外泌体中，与非外泌体负载的NCTD相比，治疗效果得到显著增强。此外，另一项研究将多柔比星（DOX）负载在肿瘤分泌的外泌体中[32]，显示出对肝癌细胞和癌症干细胞较强的细胞毒性。外泌体可以负载一种甚至多种药物，对癌细胞发挥协同杀伤作用。Du等[33]构建了一种负载铁死亡诱导剂和光敏剂的外泌体，通过化学疗法和光动力疗法联合使用，放大铁死亡在肿瘤治疗中的作用。化学疗法联合光动力疗法弥补了单一疗法疗效不足的缺点，并且由于联合治疗减少了毒性药物的使用剂量，从而降低了毒副作用。

化学治疗方案的成功很大程度上取决于高效和精确的药物递送，从而减少细胞毒性。外泌体通过工程化修饰可以负载多种药物，实现共同递释，从而提升治疗效果。协同治疗是目前外泌体治疗的热点内容，可以加强对癌细胞的杀伤，发挥更强的治疗作用。

2.1.2 工程化外泌体负载核酸药物用于肝癌的基因治疗 这种治疗效果取决于核酸药物的靶向和递送效率，其中核酸包括特异性DNA、mRNA和miRNA等，但核酸常带负电且亲水，不能直接穿透细胞膜，容易被酶降解，因此不能有效运输到细胞中[34]，工程化外泌体可以负载核酸运输到细胞中。此外，肝癌确诊时多为中晚期而失去手术的机会，很多情况下只能通过经动脉化疗栓塞和药物联合治疗[35]，但是药物长期使用容易产生耐药性，因此迫切需要提高肝癌对化学药物的敏感性。一方面工程化外泌体可以在肝癌细胞中降低耐药性，Xu等[36]研究发现，含有miRNA-451a的外泌体显著降低了对紫杉醇的耐药，通过抑制上皮-间质转化（epithelial mesenchymal transformation，EMT），促进肝癌细胞的凋亡；另一方面工程化外泌体可以增强肝癌细胞对化学药物的敏感性，Lou等[37]构建了含有miR-199a修饰的外泌体，这种工程化外泌体被证实可通过mTOR途径改善肝癌细胞对阿霉素的敏感性。总之，随着工程化外泌体的不断发展将为基因治疗提供动力。

2.2 工程化外泌体作为治疗性的肿瘤疫苗在肝癌治疗中的应用

最近，基于肿瘤特异性抗原的个体化疫苗已经在乳腺癌和黑色素瘤中进行了研究，并取得了较好的进展[38-39]。肝癌由于组织内部复杂的异质性使得肝癌的个体化肿瘤疫苗治疗效果不佳。癌症免疫疗法是一种新兴的治疗方式，旨在激活受损的免疫系统。肿瘤疫苗可以通过将肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原与免疫佐剂一起递送到抗原呈递细胞中，激活肿瘤特异性免疫应答，以引发有效的抗肿瘤免疫反应，从而特异性杀伤肿瘤细胞[40]。因其强大而持久的抗肿瘤效果，一直是研究热点之一。树突状细胞（DC）是癌症疫苗载体的常用方法之一[41]，DC作为体内抗原提呈能力最强的细胞，处于人体免疫应答的中心环节，DC可以负载多种形式的肿瘤特异性抗原，如肿瘤裂解物、多肽、mRNA等，具有广泛的免疫刺激活性，免疫应答更持久。然而DC疫苗的生产成本较高且不易保存，DC衍生的外泌体含有亲本细胞所必要的免疫刺激成分，常用于肿瘤免疫治疗的无细胞肿瘤疫苗[42]。有研究发现，肝癌的靶向肽P47和AFP212负载到DC衍生的外泌体中，可以靶向到肝癌细胞中，并募集内源性DC激活肿瘤抗原的交叉呈递，形成强大的抗肿瘤免疫反应，从而杀伤癌细胞[43]。DC衍生的外泌体保留了亲本细胞的免疫刺激，是目前研究的重点，其他来源的外泌体，包括肿瘤细胞和各种免疫细胞亚群，也可能引发有效的抗肿瘤免疫反应。

3 小结与展望

工程化外泌体包括表面修饰和功能装载，分别赋予外泌体靶向性和装载治疗药物的潜力。外泌体一方面作为理想的药物载体，可以装载化学药物、核酸等，增强对肝癌细胞的杀伤作用和降低耐药性；另一方面可以作为无细胞肿瘤疫苗，激活自身免疫系统和产生免疫记忆，从而清除肿瘤。目前许多动物实验已经证实工程化外泌体在肝癌治疗中有显著靶向治疗作用，具有良好的应用前景，但工程化外泌体仍然存在产量低、存储难等问题。随着生物工程技术的不断发展，工程化外泌体在肝癌治疗中的研究也将不断推进。