抵抗素基因多态性与结直肠癌易感性的相关性

王 琳, 刘 冰, 刘国华, 杨邯平

(河北省邯郸市第一医院 普外科, 河北 邯郸, 056000)

结直肠癌是常见的消化道恶性肿瘤之一，其发病率和病死率随人口老龄化加剧以及居民膳食结构改变而上升[1]。结直肠癌早期临床症状不显著，发现时绝大部分患者已处中晚期，严重影响生理和心理健康[2]。抵抗素是由脂肪细胞分泌的富含半胱氨酸的细胞因子，与肥胖、糖尿病等疾病密切相关[3]。研究[4]显示，抵抗素基因位点rs1862513C/G的多态性与类风湿性关节炎等疾病相关，证实其基因位点突变可能与炎症机制存在联系。研究[5]表明，结直肠癌等癌症患者中抵抗素水平呈异常低表达。但目前关于抵抗素基因多态性与结直肠癌相关性的研究较少，因此，本研究探讨抵抗素基因位点rs1862513C/G多态性与结直肠癌易感性的关系，以期为结直肠癌患者诊断和治疗提供潜在的基因标志物。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2018年1月—2020年1月本院就诊的结直肠癌患者56例为研究对象(病例组)，平均年龄(51.83±13.24)岁; 选取同期结直肠腺瘤患者52例为对照组，平均年龄(50.64±13.06)岁; 选取同期60例健康体检者作为健康组，平均年龄(52.38±12.46)岁。

纳入标准: ① 符合诊断标准[6], 经纤维结肠镜活检或切除并经病理证实者; ② 未合并其他类型的恶性肿瘤者; ③ 临床资料及组织标本保留完整、无缺损者; ④ 结直肠癌患者、结直肠腺瘤及健康体检者均为汉族; ⑤ 详细了解研究内容后自愿参加，并签署同意书者。排除标准: ① 伴有心、肝、肾等器质性病变者; ② 有细胞分子靶向治疗史患者; ③ 伴有内分泌疾病、高血压病等疾病者。本研究经医院临床研究伦理委员会审核并批准。收集整理受试者性别、体质量指数(BMI)、饮食习惯、排便、肠道状况等一般资料。

1.2 主要试剂与仪器

SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ(货号RR820A)购自日本Takara公司; 抵抗素ELISA试剂盒(型号CSB-E06884h)购自上海恒斐生物科技有限公司; 脂联素ELISA试剂盒(型号20000)购自上海广锐生物科技有限公司; 瘦素ELISA试剂盒(型号10-1199-01)购自广州市进德生物科技有限公司。凝胶成像仪(型号Gel Doc EZ), 购自美国Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 血清抵抗素、脂联素和瘦素水平测定: 采集研究对象第2天清晨空腹静脉血10 mL, 采用离心机于3 000转/min转速下离心15 min, 收集上层血清至干燥的离心管中，之后迅速置于-80 ℃超低温冰箱中保存待测。采用酶联免疫吸附(ELISA)法检测血清脂联素、抵抗素、瘦素水平，严格按照试剂盒说明书的操作步骤进行。

1.3.2 抵抗素基因型检测: 采用上海莱枫生物科技有限公司提供的基因组DNA提取试剂盒提取血清中DNA, DNA提取参照试剂盒说明书进行。聚合酶链反应(PCR)引物由上海生工生物工程有限公司合成，序列见表1。PCR反应体系(25 μL): 模板DNA 2.0 μL, 上、下游引物各0.5 μL, MgCl21.5 μL, 10×PCR Buffer 2.5 μL, dNTP 2.0 μL, Taq DNA polymerase 0.2 μL, ddH2O 加至25 μL。PCR反应程序: 95 ℃ 5 min; 95 ℃ 30 s, 60 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s, 共40个循环; 72 ℃ 5 min。电泳，凝胶成像仪分析，任意取包含3种基因型的单一条带产物(16个)纯化并测序，BLAST比对测序结果。

表1 PCR引物序列

1.4 统计学分析

2 结 果

2.1 3组一般资料比较

3组年龄、性别、BMI比较，差异无统计学意义(P>0.05)。病例组饮食不规律、排便不规律、肠道出现息肉及炎症患者的例数多于健康组，肠道出现息肉及炎症患者的例数多于对照组，差异有统计学意义(P<0.05), 见表2。

表2 3组一般资料比较

2.2 3组血清抵抗素、脂联素和瘦素水平比较

病例组抵抗素水平低于健康组和对照组，脂联素、瘦素水平高于健康组和对照组，差异均有统计学意义(P<0.05); 对照组抵抗素水平低于健康组，脂联素、瘦素水平高于健康组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 3组血清抵抗素、脂联素和瘦素水平比较 ng/mL

2.3 3组抵抗素基因多态性rs1862513位点各基因型的分布及遗传平衡检验

健康组、对照组及病例组各基因型均符合Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05), 提示所选样本进行群体遗传学研究具有代表性，均来自同一孟德尔群体。抵抗素基因在rs1862513位点上有3种基因型，分别为GG型、GC型、CC型。健康组GG型基因型最多, CC型基因型最少; 对照组GC型基因型最多, CC型基因型最少; 病例组CC型基因型最多, GG型基因型最少。见图1、表4。

A为CG基因型; B为CC基因型; C为GG基因型。箭头处为基因多态性位点。图1 病例组抵抗素基因多态性位点rs1862513的基因型碱基测序图

表4 抵抗素基因多态性rs1862513位点基因型分布及Hardy-Weinberg遗传平衡检验[n(%)]

2.4 结直肠癌各基因型患者血清抵抗素、脂联素、瘦素水平比较

CC型结直肠癌患者血清抵抗素水平低于GG型和GC型，脂联素、瘦素水平高于GG型和GC型，差异均有统计学意义(P<0.05); GC型结直肠癌患者血清抵抗素水平低于GG型，脂联素、瘦素水平高于GG型，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表5。

表5 结直肠癌各基因型患者血清抵抗素、脂联素、瘦素水平比较 ng/mL

2.5 结直肠癌的影响因素分析

将结直肠癌是否发生作为因变量，校正饮食习惯、排便、肠道状况等混杂因素后，以抵抗素基因的GG型基因型、GC型基因型、CC型基因型为自变量进行Logistic多因素回归分析，结果显示, CC型基因型是结直肠癌的独立危险因素(P<0.05)。见表6。

表6 影响结直肠癌发生的多因素分析

3 讨 论

结直肠癌的高发病率和病死率已严重危害人类生活质量和生命健康[7]。结直肠癌的发病机制及病因至今仍未完全明确，但随着现代检测技术的不断进步，人们逐渐认识到结直肠癌是一个涉及多个基因的疾病[8]。研究[9]显示，结直肠癌的发生与饮食、个人、遗传、环境等有关，而环境因素致癌主要取决于个人对肿瘤的易感性，而相关研究表明基因多态性与结直肠癌易感性有密切联系。

抵抗素具有多种生物学功能，可通过拮抗胰岛素使血糖水平不断升高，同时可对脂肪细胞分化产生抑制性作用，加速脂肪细胞的增生，进而影响肥胖的发生[10-11]。抵抗素基因位点(rs1862513)C/G多态性的出现表明体内有较高的转录活性和表达增强[12-13]。研究[14]表明，抵抗素基因rs1862513位点的基因多态性与癌症发生风险有关。本研究结果显示，结直肠癌患者基因型中CC型最多(42.86%), 其次为GC型(32.14%), GG型最少(25.00%); 而健康体检者基因型中GG型最多(60.00%), 其次为GC型(33.33%), CC型最少(6.67%); CC型基因型是影响结直肠癌发生的独立危险因素。本研究与罗俊等[15]研究坏死性小肠结肠炎患儿中抵抗素基因rs1862513位点各基因型的分布基本一致，提示CC基因型与GG基因型相比可能增加了结直肠癌的发病风险，推测其可能是因为抵抗素基因rs1862513位点C/G的多态性与血管的损害有关，可造成肠道缺血、缺氧等病变，最终引发结直肠癌。此外，本研究中结直肠癌患者血清抵抗素水平低于健康人群和结直肠腺瘤患者，脂联素、瘦素水平高于健康人群和结直肠腺瘤患者，与相关研究[5]结果一致; CC型结直肠癌患者血清抵抗素水平低于GG型和GC型，脂联素、瘦素水平高于GG型和GC型，提示抵抗素基因位点(rs1862513)C/G多态性的出现可能影响患者抵抗素、脂联素等的表达水平，进而加重患者病情。本研究多因素分析结果进一步表明，抵抗素CC型基因型与结直肠癌易感性有一定相关性。结合本研究相关结果进一步推测C等位基因可能对抵抗素相关基因的转录过程有重要抑制作用，进而降低抵抗素的表达，影响脂肪细胞增生及胰岛素水平，增加结直肠癌发病风险。

综上所述，抵抗素基因rs1862513位点基因的多态性可能与结直肠癌的发病风险显著相关，且CC基因型与GG、GC基因型相比均增加了结直肠癌的发病风险，可为临床早期结直肠癌的防治起到一定的借鉴作用。但本研究仍存在一定的局限性，本研究结果可能因种族和地域的不同而产生差异，因此，尚需扩大样本量进一步证实抵抗素基因rs1862513位点多态性与结直肠癌发生的关系。