含氮芥和蒽环的新型α,β-不饱和酮的合成、表征与抗肿瘤活性

黄伟婷, 何露欣, 李世晓, 丘文桦, 赵 曦, 王戴妮, 龚晓璇, 梁远维*

(1. 广东海洋大学 化学与环境学院,广东 湛江 524088; 2. 辽宁省环保集团科源环境技术有限公司,辽宁 沈阳 110161)

蒽类化合物是天然产物中一类比较重要的活性成分,主要分布在蓼科、鼠李科、茜草科、豆科、百合科和玄参科等高等植物中。蒽类化合物存在形式多样,包括氧化蒽酚、蒽酚和蒽酮等[1]。许多蒽类衍生物具有不同的生理活性,主要表现为降血脂、利尿、抗氧化和抗肿瘤等,尤其是抗肿瘤方面表现出较大的潜力[2]。但由于蒽类衍生物种类繁多,活性参差不齐,很多情况下需通过原材料进行分离提纯,大大限制了蒽类化合物的应用和开发。因此,对蒽类化合物进行结构修饰,获得理想活性的药物,具有重要的现实意义。

α,β-不饱和酮衍生物在天然产物和药物分子中分布广泛,由于其独特的结构特征,在合成化学领域有重要研究前景[3]。α,β-不饱和酮不仅是重要的有机合成中间体,广泛应用于化学和材料等领域,还具有显著的生物药理活性及独特的可塑性结构,在抗肿瘤、抗炎、抗氧化和抗菌等方面有潜在应用价值[4]。α,β-不饱和酮衍生物在抗肿瘤方面具有细胞毒性小,选择性高的特点[5]。

氮芥类药物是最早应用于抗肿瘤作用的药物之一,也是目前抗肿瘤药用研发的重要方向之一。氮芥类药物是一类高度活泼的基团,主要由氮芥部分和载体部分组成,在临床上有广泛的应用[6]。氮芥部分是抗肿瘤药的活性功能基团,载体部分主要影响药物的物化性质,以及在体内的吸收、分布等药代动力学性质[7]。虽然氮芥类药物抗瘤谱广、对肿瘤细胞杀伤力强,但仍存在生物利用度低、选择性差且毒副作用大等缺点[8]。

目前,关于含氮芥和蒽环的α,β-不饱和酮衍生物的抗肿瘤药物尚未见报道,本文拟将氮芥、蒽环和α,β-不饱和酮等3个单元进行结合,合成含氮芥和蒽环的新型α,β-不饱和酮(1a和1b,图1),其结构经紫外、荧光光谱、质谱和核磁共振等表征。通过MTT试验法检测目标化合物对A549、 786-O、 Hela和MDA-MB-231等4种肿瘤细胞的抗增殖活性,比较了2个化合物的活性,并进一步探讨化合物对肿瘤细胞的抗转移作用和对细胞周期的影响。

图1 含氮芥和蒽环的α,β-不饱和酮的合成路线

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

BRUKER AVANCE 300/600 MHz型核磁共振仪(TMS为内标);Waters Xevo G2-XS Tof型飞行时间质谱仪;RF-6000型荧光分光光度计;TU-1901型紫外可见分光光度计;Thermo Multiskan FC型酶标仪;Beckman Gallios型流式细胞仪。

所用试剂均为分析纯(毕得医药科技有限公司)。

1.2 1a和1b的合成通法

将N,N-二甲基甲酰胺(9 mmol, 657 mg),三氯氧磷(5 mmol, 767 mg)和N,N-二羟乙基苯胺(2 mmol, 362 mg)加入圆底烧瓶中,加热至90 ℃,反应3 h。将液体倒入冰水中,用1M NaOH溶液调节pH≈7,过滤,滤饼依次用纯水和冷乙醇洗涤两次,真空干燥得中间体4-[双-(2-氯乙基)氨基]苯甲醛(化合物2),淡黄色固体449 mg,产率 85%;1H NMR(300 MHz, DMSO-d6)δ: 9.72(s, 1H, CHO), 7.72(d,J=8.89 Hz, 2H, ArH), 6.90(d,J=8.89 Hz, 2H, ArH), 3.85(t,J=5.78Hz, 4H, CH2), 3.79(t,J=5.78 Hz, 4H, CH2); HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C11H14Cl2NO{[M+H]+}246.0452, found 246.0468。

将化合物2(1 mmol, 246 mg)、 9-乙酰蒽或2-乙酰蒽(1 mmol,220 mg)和碱催化剂(NaOH, K2CO3或三乙胺,1 mmol)加入乙醇(13 mL)中,反应24 h。除去乙醇,残余物经硅胶柱层析(洗脱剂:CH2Cl2∶CH3OH=45 ∶1,V∶V)纯化得目标化合物1a和1b。

化合物1a:黄色固体368 mg,产率82%, m.p.127.6～128.6 ℃;1H NMR(600 MHz, DMSO-d6)δ: 8.73(s, 1H, ArH), 8.18(d,J=8.51Hz, 2H, ArH), 7.81(d,J=8.49 Hz, 2H, ArH), 7.57～7.52(m, 4H, ArH), 7.46(d,J=8.96 Hz, 2H, ArH), 7.22(d,J=16.07 Hz, 1H, CH), 7.05(d,J=16.07 Hz, 1H, CH), 6.73(d,J=8.96 Hz, 2H, ArH), 3.78(t,J=6.20 Hz, 4H, CH2), 3.72(t,J=6.20 Hz , 4H, CH2);13C NMR(150 MHz, DMSO-d6)δ: 198.96, 149.61, 148.52, 135.68, 131.58, 131.15, 129.15, 128.24, 128.06, 127.15, 126.09, 125.40, 124.88, 122.62 122.42, 52.12, 41.44; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C27H24Cl2NO{[M+H]+}448.1235, found 448.1234。

化合物1b: 黄色固体341 mg,产率76%, m.p.129.8～130.8 ℃;1H NMR(600 MHz, DMSO-d6)δ: 8.96(s, 1H, ArH), 8.72(s,1H, ArH), 8.31(d,J=8.70 Hz, 1H, ArH), 8.13(dd,J=8.17 Hz, 13.19 Hz, 2H, ArH), 7.94(d,J=6.80 Hz, 1H, ArH), 7.67(d,J=8.93 Hz, 2H, ArH), 7.64(dd,J=6.90 Hz, 8.62Hz, 1H, ArH), 7.62～7.56(m, 3H, ArH, CH), 7.39(d,J=15.61 Hz, 1H, CH), 6.94(d,J=8.97 Hz, 2H, ArH), 3.84(t,J=6.81 Hz, 4H, CH2), 3.78(t,J=6.11 Hz , 4H, CH2);13C NMR(150 MHz, DMSO-d6)δ: 194.49, 149.31, 146.34, 137.41, 132.22, 132.15, 131.89, 131.57, 131.46, 129.02, 128.33, 128.25, 127.81, 127.38, 126.65, 126.63, 124.91, 124.81, 123.26, 122.37, 112.44, 52.21, 41.51; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C27H24Cl2NO{[M+H]+}448.1235, found 448.1233。

1.3 体外抗增殖活性测试

将处于对数生长期的肿瘤细胞(A549、 786-O、 Hela和MDA-MB-231)接种于96孔板(接种密度2×103cells/well)。待细胞贴壁后,每孔加入不同浓度的1a或1b(0、 1、 2、 4、 8、 16、 32和64 μM),于37 ℃孵育72 h,吸弃96孔板内的培养基,每孔加入25 μL MTT试剂,在培养箱内孵育3 h。MTT在活细胞内被还原为不溶于水的蓝紫色结晶甲臜(λmax=570 nm),而死细胞无此功能,因此甲臜形成的量与活细胞数成正比。用DMSO将其溶解后,通过酶标仪读取每孔OD570数值,计算不同浓度药物处理后细胞的存活率[9]。

1.4 细胞划痕实验

将对数生长期的Hela细胞接种于6孔板(4×105cells/well),待贴壁后,用枪头在细胞生长的中央区域垂直划线,碎片用PBS清洗并吸弃,添加培养基,加入不同浓度的化合物1a并孵育至设定的时间,吸弃培养基后加入Hoechst染料于37 ℃孵育染色30 min,用PBS清洗2次后,在倒置荧光显微镜下拍照[10]。

1.5 细胞周期实验

将细胞接种于10 cm细胞培养皿中(1×106cells/well),贴壁后加入药物,待药物作用48 h后,将细胞消化收集于离心管,扣干,用PBS重悬1次再扣干,并用72%酒精固定温度于4 ℃, 12 h后离心扣干,加入300 μL PI染色,避光孵育30 min。用尼龙网过滤后加入上机样品管内,用流式细胞仪进行分析检测,得出细胞处于G1期,S期和G2/M期的比例[11]。

2 结果与讨论

2.1 合成分析

含氮芥和蒽环的α,β-不饱和酮的合成路线见图1,起始原料为N,N-二羟乙基苯胺,第一步反应由POCl3和DMF组成的Vilsmeier-Haack试剂对苯环进行甲酰化反应[12],该反应为亲电取代反应,过量的POCl3对2个羟基进行氯化反应得到化合物2。这里由于氮原子p轨道孤对电子与苯环形成p-π共轭,增大了苯环的电子云密度,活化了苯环,因此该甲酰化亲电取代反应较为容易进行,产率也较高(85%)。第二步反应为典型的羟醛缩合反应[13],蒽环上的乙酰基先在碱的作用下生成碳负离子,接着进攻醛基的碳原子,发生亲核加成反应,得到的β-羟基酮进一步脱水,生成α,β-不饱和酮,即为含氮芥和蒽环的α,β-不饱和酮1a和1b。反应温度为室温,反应时间为24 h。

羟醛缩合反应是制备α,β-不饱和醛酮的重要方法[14]。为了比较不同的催化剂对产率的影响,选择了3种碱(NaOH、 K2CO3和三乙胺)作为催化剂进行筛选。其中强碱NaOH做催化剂时产率较高,1a和1b产率分别为82%和76%;而弱碱K2CO3催化时几乎没有产物生成,产率均小于1%;用有机碱三乙胺催化时产率也非常低,1a和1b产率仅有2%和3%，这是因为需要较强的碱才能将乙酰基的氢拔除,而K2CO3和三乙胺较难拨氢,碳负离子难以生成,无法得到较多的产物。

表1 不同碱催化剂对目标产物产率的影响

2.2 结构表征分析

氢谱在化合物的表征中是必不可少的,下面对化合物1a的核磁共振氢谱进行解析。图2中δ8.73处为5号碳上的氢,单峰;δ8.18处为1号碳上的氢,受2号碳上的氢影响裂分为d峰,偶合常数为8.51 Hz;δ7.81处为4号碳上的氢,受3号碳影响裂分为d峰;δ7.57～7.52处为2号碳和3号碳上的氢(重叠);δ7.46处为8号碳上的氢受9号碳上的氢影响裂分为d峰,偶合常数为8.96 Hz;δ7.22处为7号碳上的氢裂分为d峰,偶合常数为16.07 Hz;δ7.05和6.74处分别为6号碳和9号碳上的氢,分别受7号碳和8号碳上的氢影响裂分为d峰;δ3.78和3.72处为10号和11号亚甲基的氢,各为三重峰。

图2 化合物1a的核磁共振氢谱

λ/nm

紫外-可见光谱可有效表征化合物在紫外至可见光波段的吸收性能,荧光光谱则表征化合物在紫外或可见光照射下发射电磁波的性能。紫外光谱和荧光光谱在发光材料和染料等领域发挥着重要作用,能对化合物的发色团提供很好的表征信息[15]。由于合成的化合物1a和1b具有较大的共轭体系,因此,其紫外最大吸收波长和荧光的最大发射波长会红移。化合物1a和1b的紫外(实线)和荧光光谱(虚线)如图3所示,1a在乙醇中的最大吸收波长为396 nm;以396 nm为激发波长,测得荧光光谱的最大发射波长为583 nm(图3a)。化合物1b的最大吸收波长为395 nm,荧光光谱的最大发射波长为574 nm(图3b)。从结构上看,化合物1a和1b具有的最大吸收波长和最大发射波长主要归因于蒽环、α,β-不饱和酮和氮芥结构p轨道电子的大共轭体系。

λ/nm图3 化合物1a(a)和1b(b)在乙醇中的紫外吸收光谱(实线)和荧光光谱(虚线)

2.3 体外抗肿瘤活性

化合物1a和1b对A549、 786-O、 Hela和MDA-MB-231肿瘤细胞增殖的抑制活性见图4,半抑制浓度(IC50, μM)见表2。由图4和表2可知,2个化合物对Hela细胞的抑制效果最好。其中1a对上述细胞的半抑制浓度(IC50)为28.8 μM、 23.5 μM、 18.3 μM和27.1 μM。1b对肿瘤细胞的IC50值分别为33.4 μM、 27.1 μM、 24.9 μM和27.5 μM。以上结果证实,2个化合物1a和1b对肿瘤细胞具有良好的抗增殖活性,并且化合物1a的抗增殖活性略优于1b。

c/μM图4 化合物1a和1b对肿瘤细胞A549、 786-O、 Hela和MDA-MB-231的抗增殖活性

2.4 化合物1a的抗肿瘤转移作用

转移是恶性肿瘤的基本特性之一,很多肿瘤治疗失败的主要原因是因为转移。因此相对肿瘤的转移而言,预防比治疗更重要。细胞划痕实验可以体现不同处理组的细胞迁移的能力。图5a中仅经过24 h,不加药组的Hela细胞表现出非常强的迁移能力,而加药组的细胞迁移则明显受到抑制,并随着浓度增加,抑制效果更为显著,呈现浓度依赖关系。对应统计图见图5b,经过24 h后,不加药组的细胞相对迁移距离为49.5%。当化合物1a加药浓度分别为20 μM时,相对迁移距离百分数为74.6%,可知化合物1a明显抑制了Hela细胞的迁移。当浓度为40 μM时,相对迁移距离百分数为83.2%,Hela细胞的迁移进一步被1a抑制。由以上结果可知,化合物1a可通过降低肿瘤细胞的转移能力来发挥抗肿瘤作用,具有很好的抗肿瘤转移作用。

表2 化合物1a和1b对肿瘤细胞的半抑制浓度(IC50, μM)

2.5 化合物1a对Hela细胞周期的影响

细胞周期分布可以体现细胞每个时期的比例,进而反应药物对周期的影响[16]。由图6可知,S期的比例随着加药浓度的增加而增加。不加药组的G1、 S和G2/M期的比例分别为54.1%, 30.8%和15.1%;当1a浓度为20 μM时,G1期的比例下降为20.9%。而S和G2/M期则分别升高到49.9%和29.2%;当浓度上调到40 μM时,G1期的比例进一步下降到12.3%, S期的比例显著升高到67.7%,而G2/M期的比例降低到20.0%。由此可知,S期的比例升高总体上呈浓度依赖关系,同时G1和G2/M期没有明显的增加,说明化合物1a能有效使Hela细胞阻滞于S期而发挥抗增殖作用。

DNA Content图6 化合物1a对Hela细胞周期的影响

本文运用Vilsmeier-Haack反应和羟醛缩合反应,合成了2种含氮芥和蒽环的新型α,β-不饱和酮,两步反应都具有较高的产率。从体外抗肿瘤实验结果可知:1a和1b具有良好的抗肿瘤活性,能有效地抑制多种肿瘤细胞的增殖。其中,1a较1b的抗增殖活性稍强。1a具有优异的抗肿瘤转移作用,并且通过使Hela细胞的周期阻滞在S期而发挥抗增殖作用。