基于UPLC-Q-TOF-MS技术的竹叶花椒果皮中黄酮类成分分析

周孟焦，何鑫柱, ，李朝俊, ，梁晓峰,

1. 四川中医药高等专科学校川西北中药材资源研究与开发利用实验室（绵阳 621010）；

2. 西南科技大学材料科学与工程学院（绵阳 621010）

竹叶花椒（Zanthoxylum armatumDC.）为芸香科花椒属植物，作为药食同源植物，竹叶花椒以“竹叶椒”之称在历代本草中均有记载，具有温中止痛、祛蛔、祛风除湿等作用[1-2]。竹叶花椒果皮中含有黄酮类、挥发油、酰胺和生物碱等多种活性成分[3]，其中黄酮类物质是主要的活性成分之一，具有抗氧化、抗炎、抗衰老和抗癌等药理功效[4-5]。竹叶花椒中的黄酮类物质成分复杂，其具体所含有的黄酮类物质尚不明确，因此，阐明其药效基础物质对进一步深入研究药物作用机制具有重要作用。

超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱技术（Ultra-Performance Liquid Chromatography Quadrupole Time-of-Flight Mass Spectrometry，UPLC-Q-TOFMS）具有快速、高效的特点，是分析中药复杂系统中化学成分的最有力工具之一，现已被广泛运用到药效物质基础研究、化学成分分析等领域[6-7]。试验采用UPLC-Q-TOF-MS技术对竹叶花椒含有的黄酮类物质进行分析、鉴定，为竹叶花椒药材的药效物质基础研究和综合开发利用提供科学指导。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Agilent 1290超高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；Agilent Q-TOF 6520质谱仪（美国安捷伦公司）；Sartorius BSA124S分析天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；UltiMate 3000高效液相色谱仪（美国赛默飞公司）；RE52CS-2旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；YTLG-12A冷冻干燥机（上海叶拓科技有限公司）；XH-MC-1实验室微波合成仪（祥鹄科技）；DHG-9075A电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）。

干燥竹叶花椒果皮产自四川汉源，经四川中医药高等专科学校江洪波教授鉴定为芸香科花椒属植物竹叶花椒Zanthoxylum armatumDC.的果皮；石油醚、无水乙醇（分析纯，成都市科隆化学品有限公司）；甲醇和甲酸（色谱纯，Merck公司）；聚酰胺和D101大孔吸附树脂（上海麦克林生化科技）；表儿茶素、芦丁、金丝桃苷、阿福豆苷、紫云英苷、槲皮苷、异鼠李素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素、异鼠李素和山奈酚分析对照品[阿拉丁试剂（上海）有限公司]。

1.2 试验方法

1.2.1 供试品溶液的制备

称取适量竹叶花椒果皮粉末，用微波辅助法进行提取，溶剂为60%乙醇水溶液，在80 ℃下反应25 min，提取液用石油醚进行脱脂处理，再冷冻干燥得到黄酮粗提物，用聚酰胺-大孔吸附树脂对提取物进行纯化，得到淡黄色粉末状黄酮纯化物。精密称取适量纯化黄酮固体粉末，用甲醇定容至10 mL容量瓶中，即得供试品溶液。

1.2.2 超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱测试条件

1.2.2.1 色谱条件

waters BEH C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为甲醇溶液；梯度洗脱（0～1 mim，5% B；1～3 min，5%～10% B；3～16 min，10%～90% B；16～22 min，90% B；22～22.1 min，90%～5% B；22.1～30 min，5% B）；流速为0.3 mL/min；柱温25 ℃；进样量为2 μL。

1.2.2.2 质谱条件

采用电喷雾离子源（ESI），正离子模式监测，离子喷雾电压为4 000 V；毛细管温度为350 ℃；干燥气流速为12 L/min；质量扫描范围为m/z100～1 500。

1.2.3 高效液相色谱测试条件

色谱柱为反相PA2 C18（50 mm×4.6 mm，3 μm）；流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为甲醇溶液；梯度洗脱（0～1 mim，5% B；1～3 min，5%～10% B；3～16 min，10%～90% B；16～22 min，90% B；22～22.1 min，90%～5% B；22.1～30 min，5% B）；检测波长为300 nm；流速为1 mL/min；柱温25 ℃；进样量为30 μL。

2 结果与分析

2.1 竹叶花椒黄酮类物质的成分

竹叶花椒提取物的正离子基峰色谱图（Base Peak Chromatogram，BPC）见图1。利用Qualitative Analysis B.07.00分析软件，对正离子模式下采集的数据进行分析处理。根据准分子离子峰，确定化合物的相对分子质量；通过数据库检索、查看化合物二级质谱碎片、结合质谱裂解规律和相关文献鉴定样品中的化学成分，共分析鉴定出10种黄酮类物质，其具体鉴定结果见表1。

图1 竹叶花椒提取物正离子模式下的BPC图

表1 竹叶花椒黄酮类物质的鉴定结果

2.2 典型黄酮类物质的鉴定

在黄酮类物质中，金丝桃苷、芦丁、紫云英苷和异鼠李素-3-O-葡萄糖苷等具有优异的药理活性，常用于解痉、心脑血管疾病、抗炎和降血脂等。利用液-质联用技术可对天然黄酮类物质组分进行快速测定，分析表明，竹叶花椒提取物中含有这些典型的黄酮成分。

峰3代表的化合物在正离子模式下出现的一级质谱碎片信息，有m/z465.104 [M+H]+和m/z487.085[M+Na]+，表明化合物3的相对分子质量为464，m/z465.104 [M+H]+失去一分子葡萄糖（m/z162）或半乳糖基（m/z162）得到m/z303.050，该黄酮类物质的苷元为槲皮素，初步鉴定该峰代表的物质为槲皮素-3-O-葡萄糖苷或槲皮素-3-D-半乳糖苷（金丝桃苷），再根据文献[8, 11]，结合数据库分析，推测该物质为金丝桃苷，其质谱图和裂解途径如图2所示。

图2 金丝桃苷的一级（a）、二级（b）质谱图和裂解途径（c）

峰4代表的化合物的全扫描一级质谱碎片信息中有m/z611.161 [M+H]+和m/z633.143 [M+Na]+，表明化合物4的相对分子质量为610，其二级质谱碎片离子中m/z465.102为[M+H]+失去一分子鼠李糖基（m/z146）生成的，m/z303.050为[M+H]+失去一分子鼠李糖和葡萄糖基生成的，再根据文献[8, 9]，结合数据库分析，推测该峰代表的物质为芦丁，其裂解途径和质谱图如图3所示。

图3 芦丁的一级（a）、二级（b）质谱图和裂解途径（c）

峰5代表的化合物的准分子离子峰为m/z449.108[M+H]+和m/z471.087 [M+Na]+，表明化合物5的相对分子质量为448，其二级质谱碎片m/z287.055 [M+H-162]+，由m/z449.108 [M+H]+失去一分子葡萄糖或半乳糖基得到的，m/z287.055 [M+H-162]+代表的苷元是山奈酚，再根据文献[10]，结合数据库分析，推测该峰代表的物质为紫云英苷。

峰7代表的化合物的准分子离子峰为m/z479.119[M+H]+和m/z501.100 [M+Na]+，表明化合物7的相对分子质量为478，二级质谱碎片中m/z317.066 [M+H-162]+由m/z479.119 [M+H]+和失去一分子萄糖或半乳糖基得到的，m/z303.045 [M+H-162-CH3]+由m/z317.066[M+H-162]+失去一个中性离子CH3得到的，m/z317.066[M+H-162]+所代表的苷元为异鼠李素，再根据文献[11]，结合数据库分析，推测该峰代表的物质为异鼠李素-3-O-葡萄糖苷。

2.3 竹叶花椒黄酮类物质的对照品比对分析

竹叶花椒提取物与混合对照品的高效液相色谱如图4所示。由图4可知，竹叶花椒提取物中具有表儿茶素、芦丁、金丝桃苷、阿福豆苷、紫云英苷、槲皮苷、异鼠李素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素、异鼠李素和山奈酚这10种黄酮类物质，表明了UPLC-Q-TOF-MS技术可快速、有效地对竹叶花椒黄酮类物质进行分析。

图4 混合对照品（a）和竹叶花椒提取物（b）的HPLC图

3 结论

试验通过UPLC-Q-TOF-MS技术对竹叶花椒提取物中黄酮类物质进行分析，共分析鉴定出10种黄酮类物质，分别是表儿茶素、芦丁、金丝桃苷、阿福豆苷、紫云英苷、槲皮苷、异鼠李素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素、异鼠李素和山奈酚。采用UPLC-Q-TOF-MS技术可快速、有效地对竹叶花椒黄酮类物质进行分析。此次研究为竹叶花椒进一步开发研究提供了科学参考，促进了竹叶花椒有效物质基础研究。