鸡肉冻干粉中磺胺类药物残留标准物质的研制

贾润宇，吕铮，王一名，余丽波，张凡，余洋*

1. 中国检验检疫科学研究院（北京 100176）；2. 中检科（北京）测试认证有限公司（北京 100176）

磺胺类药物具有抗菌谱广、药效稳定、疗效确实、价格低廉、使用方便等[1-2]优点，使其在畜牧及动物医疗领域得到广泛应用。磺胺类兽药能通过动物代谢从而污染环境，破坏生态环境，影响人身健康[3-5]。因此，对动物源中磺胺药物残留开展严密监控对保障食品质量安全和人民身体健康具有重要意义。为保证监测结果的准确可靠，需要相应的标准物质作为支撑，然而查阅国家标准物质资源共享平台[6]，未见动物源基体标准物质。国内对于兽药残留基体标准物质的研究及研制尚处在初级阶段。郭德华等[7]研制含氯霉素、克伦特罗和沙丁胺醇的鱼粉标准物质；李杰[8]研制含磺胺类及雌激素类兽药的动物性食品标准物质样品；李兰英[9]研制含磺胺类兽药的猪组织基体标准物质样品；呼念念[10]研制含硝基呋喃类兽药的鸡肉标准物质样品。在基体标准物质方面，只有蜂蜜和牛乳粉国家标准物质，无法满足基质中磺胺类药物残留的准确测定。因此，试验应用真空冷冻干燥技术、均匀化技术，以鸡肉为本底基质制备鸡肉中磺胺类药物残留标准物质，并经均匀性检验、稳定性检验和实验室联合定值[11-12]，该标准物质可用于实验室质量控制、能力验证等，对于我国的兽药残留检测技术的提升具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

磺胺甲基嘧啶固体标准品（纯度99.8%，上海安谱实验科技股份有限公司）；磺胺二甲基嘧啶固体标准品（纯度99.8%，上海安谱实验科技股份有限公司）；甲醇、乙腈（色谱纯，上海安谱实验科技股份有限公司）；甲酸（分析纯）、磷酸盐缓冲液[赛默飞世尔科技（中国）有限公司]；Na2EDTA缓冲液（天津市百世化工有限公司）。

鸡肉购买于超市。

MSM764M斩拌机（北京马多机械制造有限公司）；ms205du精密电子天平（瑞士mettler toledo公司）；B50C多功能食品搅拌机（北京永兴食品机械公司）；wizord2.0真空冷冻干燥系统（美国SP scientific公司）；GM 300刀式均质粉碎仪（德国Retsch公司）；v100高效混合机（广州市旭朗机械设备有限公司）；800/2s深凹型双室真空包装机（诸城市汇品机械有限公司）；FSH-2高速匀浆机（上海汗诺仪器有限公司）；Vortex-Genie2漩涡混合器（美国Scientific Industries公司）；LYNX4000离心机（美国Thermo公司）；LCMS-8045液相色谱-串联质谱联用仪（日本岛津公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 基质样品研制

将20 kg不含磺胺类药物的鸡肉放入斩拌机并将其打碎成肉泥，分别称取计算好的各磺胺类药物标准品，用甲醇溶解后缓慢滴加到鸡肉泥中，使用多功能食品搅拌机进行搅拌，搅拌时间为2 h，使其充分混匀，使用真空冷冻干燥机制成鸡肉冻干粉中磺胺药物标准物质，具体流程见图1。

图1 样品制备流程图

1.2.2 标准物质中磺胺类药物检测

1.2.2.1 样品处理

提取。称取1 g（精确至0.01 g）冻干粉样品，加8 mL Mcllvaine Na2EDTA缓冲液，涡旋1 min，超声20 min，在-2 ℃，10 000 r/min离心5 min，收集上清液。残渣中加8 min磷酸盐缓冲液，重复提取1次，合并提取液，混匀，备用。

净化。固相萃取柱依次使用甲醇和水活化，取备用液过柱，依次用水5 mL和20%甲醇水溶液淋洗，抽干，用洗脱液10 mL洗脱。收集洗脱液，于40 ℃水浴氮吹至近干，用初始流动相复溶，涡旋溶解后过滤膜备用。

1.2.2.2 仪器工作条件

1.2.2.2.1 液相色谱条件

色谱柱C18（150 mm×2.1 mm×1.7 m）；柱温35℃；进样量10 μL；流速0.3 mL/min；流动相A相为甲醇-乙腈（2∶8，含0.1%甲酸，体积比），B相为0.1%甲酸水溶液。

洗脱梯度（0～5 min，90% B相至10% B相；5～10 min，10% B相至70% B相，10～12 min，70% B相至40% B相；12～13 min，40% B相至0 B相；13～14 min，0B相至90% B相）。

1.2.2.2.2 质谱条件及参数

电喷雾离子源（electrosprayionization，ESI）；多反应监测（multi-reactionmonitoring，MRM）模式；正离子模式；雾化器流量3 L/min；干燥器流量10 L/min；加热器流量10 L/min；接口温度300 ℃；接口电压4.0 kV；其他质谱采集参数见表1。

表1 磺胺甲基嘧啶与磺胺二甲基嘧啶的质谱分析条件参数

1.2.3 均匀性和稳定性试验

1.2.3.1 均匀性检验

参考GB/T 15000.3—2008《标准样品工作导则（3）标准样品 定值的一般原则和统计方法》[13]，从制备的样品中随机抽取10袋，每袋重复测定3次，分析样品中磺胺类药物含量。所有样品以随机次序在重复性条件下测试，选择不低于定值方法精密度和灵敏度的测量方法，按照上述检测方法对样品进行均匀性检测，检测数据用单因素方差分析法来判断标准物质是否均匀[13]。

1.2.3.2 稳定性检验

依据GB/T 15000.3—2008[13]的规定，采用不同温度的方式，模拟检测样品运输过程中的短期稳定性，采用不同时间间隔的方式，模拟检测样品储存过程中的长期稳定性。

短期稳定性：样品在原本正常储存温度下放置72 h后，选择10，20，40和60 ℃共4个温度点，模拟运输中遇到的极端温度，采用随机抽样方式每个取样点均设置3个样品，平行测定2次，进行样品的短期稳定性分析[14]。

长期稳定性：在室温下，选择0，1，3，5，7，9和12月共7个取样时间点，采用随机抽样方式每个取样点均设置3个样品，平行测定2次，进行样品的长期稳定性分析。

式（1）～（4）依次分别表示为：稳定性评估基本模型；回归方程斜率计算方法；回归方程截距计算方法；标准偏差s（β1）计算方法，其中s表示直线上每个点的标准偏差，计算见式（5）。

式中：X为测量的时间；Y为标准物质的特性值；Xi为每次测量的时间；Yi为每次测量时标准物质的特性值；X为测量时间的平均值；Y为标准物质特性值的平均值；β0为回归方程的截距；β1为回归方程的斜率；n为测量次数；s(β1)为n次测量结果的标准偏差；s为直线上每点的标准偏差。

1.2.4 基质样品定值

标准物质定值依据GB/T 15000.3—2008[13]的规定，标准物质的定值采取6家实验室联合测定的方法，每家发2个样品，每个样品测3次，出具6个数据，各实验室均按照GB/T 20759—2006《畜禽肉中十六种磺胺类药物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》[15]或GB/T 21316—2007《动物源性食品中磺胺类药物残留量的测定 液相色谱-质谱/质谱法》[16]进行检测。分别使用夏皮洛-威尔克（Shapiro-Wilk）法、科克伦（Cochran）法、狄克逊（Dixon）法检验各实验室的组内数据是否为正态分布、各实验室间的数据是否等精度、各实验室间的数据是否有离群值，在满足上述条件的情况下对各实验室组间的数据进行正态性检验。对满足所有条件的实验室数据进行平均值计算，结果即为该样品定值结果[13-14]。

依据相关标准，试验中不确定度包括均匀性引入的不确定度、稳定性引入的不确定度、定值引入的不确定度。

2 结果与分析

2.1 鸡肉中磺胺类药物基质标准物质色谱图

运用仪器检测方法对制备的磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶基质标准物质进行测试，磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶纯标准品及试验制备的基质标准物质质谱图见图2和图3。磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶色谱图峰形尖锐对称，保留时间附近未出现干扰峰，基线平稳，表明定量数据具有一定准确性。二级质谱图中的碎片离子的质荷比与标准物质所产生的碎片离子偏差小，表明能准确定性基质标准物质中含有磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶。

图2 纯标准品和基质标准物质中磺胺甲基嘧啶的仪器检测结果图

图3 纯标准品和基质标准物质中磺胺二甲基嘧啶的仪器检测结果图

2.2 均匀性检验结果

均匀性检测结果详见表2和表3。

表2 样品中磺胺甲基嘧啶项目均匀性检测结果单位：μg/kg

表3 样品中磺胺二甲基嘧啶项目均匀性检测结果单位：μg/kg

2.3 稳定性检验结果

2.3.1 短期稳定性

短期稳定性检测结果详见表4和表5。

表4 样品中磺胺甲基嘧啶项目短期稳定性测试结果 单位：μg/kg

表5 样品中磺胺二甲基嘧啶项目短期稳定性测试结果 单位：μg/kg

2.3.2 长期稳定性

长期稳定性检测结果详见表6和表7，长期稳定趋势图见图4。

图4 磺胺甲基嘧啶和磺胺二甲基嘧啶长期稳定趋势图

表6 样品中磺胺甲基嘧啶项目长期稳定性测试结果 单位：μg/kg

表7 样品中磺胺二甲基嘧啶项目长期稳定性测试结果 单位：μg/kg

2.4 定值结果

鸡肉冻干粉中磺胺类兽药残留基质标准物质6家实验室定值结果详见表8和表9。

表8 各定值实验室检测鸡肉冻干粉中磺胺甲基嘧啶的测试结果

表9 各定值实验室检测鸡肉冻干粉中磺胺二甲基嘧啶的测试结果

对各实验室数据进行Shapiro-Wilk法检验，经计算各实验室W＞W(6,0.95)，表示在显著性水平α=0.05上符合正态分布；对各实验室数据平均值用Cochran法检验，经计算C＜C(0.05,6,6)，表示各实验室间的测量属于等精度测量；对各平均值数据用Dixon法检测，经计算满足r1＜f(0.05,6)且rn＜f(0.05,6)，表示各实验室间的测量无显著性差异。

对各实验室数据进行Shapiro-Wilk法检验，经计算各实验室W＞W(6,0.95)，表示在显著性水平α=0.05上符合正态分布；对各实验室数据平均值用Cochran法检验，经计算C＜C(0.05,6,6)，表示各实验室间的测量属于等精度测量；对各平均值数据用Dixon法检测，经计算满足r1＜f(0.05,6)且rn＜f(0.05,6)，表示各实验室间的测量无显著性差异。

2.5 不确定度

试验中不确定度包括均匀性引入的不确定度、稳定性引入的不确定度、定值引入的不确定度，计算详见式（6）～（8），再计算出标准物质的合成标准不确定度，计算详见式（9）。

式中：MSamong为样品间均方；MSwithin为样品内均方；n为测量次数；s(β1)为稳定性测量结果的标准偏差；t为稳定性测量的时间；s为定值结果的标准偏差。

经计算，研制的标准物质各项不确定度及定值结果详见表10和表11。

表10 鸡肉冻干粉中磺胺甲基嘧啶标准物质各项不确定度及定值结果 单位：μg/kg

表11 鸡肉冻干粉中磺胺二甲基嘧啶标准物质各项不确定度及定值结果 单位：μg/kg

3 结论

通过对相关标准的学习与研究，制备鸡肉冻干粉中磺胺类兽药残留基体标准物质，将鸡肉通过打碎、加标、冻干等一系列制备步骤后制得标准物质，经过均匀性及稳定性检验后，判断结果是否满足相关标准，通过6家实验室联合定值的方式对标准物质进行定值和不确定度评估，结果满足动物源性食品中兽药残留检测标准。该标准物质可用于实验室内考察检测仪器、检测方法及人员能力，对于提高基体标准物质定值的测量准确度和我国兽药残留检测技术的提升有着重要意义。