一种抗生物污染的导电高分子葡萄糖传感器

李小飞，周星银，杨琴珪，张守燕，钱思昊，朱 波

(1.中电科芯片技术(集团)有限公司，重庆 401332；2.上海大学 材料科学与工程学院，上海 200444)

0 引 言

糖尿病是一个全球性的健康问题，可对心脏、肾脏和其他器官造成慢性损害。因此，监测血液中葡萄糖(glucose,Glu)对糖尿病患者的临床诊断和日常护理具有重要意义[1]。目前,对于糖尿病患者日常监测血糖主要以刺破指尖取血测量为主，这种方式会带来身体疼痛和心理压力，还会增加外部感染的风险。随着电化学生物传感器的快速发展，电化学葡萄糖传感器可简单并迅速地测定血糖，成为一大研究热点。传感器可分为微侵入式和非侵入式两种。微侵入式设备是将微针传感头埋入手臂或腹部皮下组织中，这种方式具有微创和相对安全的特点，引发的痛感较低。非侵入式葡萄糖传感器的研究主要集中在人体汗液、泪液、唾液等体液监测方面。其中，汗液中含有多种代谢产物，组成同血液基本一致，汗液中生化标记物(如葡萄糖、钠钾离子、乳酸等)的指标浓度，可以很好地反映出血液中生化指标变化。由于汗液存在于皮肤表面，方便获得，可以做到对葡萄糖的实时监测。因此，汗液可穿戴传感器是无创传感器中研究最为广泛的，目前已取得了一些令人鼓舞的成果[2～4]。然而，复杂生物环境下的非特异性吸附和生物污染会导致生物传感器灵敏度降低、响应时间延长、检测误差扩大，甚至使传感器失效。因此，迫切需要开发能够有效抵抗复杂生物样品非特异性吸附的抗污染生物传感器。

常用的抗污染策略主要通过加入防污聚合物,达到传感器抗污的目的，聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)及其衍生物以及两性离子物质(磷酸胆碱(phosphoryl choline，PC)、磺基甜菜碱(sulfo-betaine，SB)和羧基甜菜碱(carboxy-betaine，CB))是最广泛使用的防污材料。相关研究表明，将两性离子与导电聚合物共轭的防污材料可以提高电化学传感器的灵敏度并弥补大多数防污分子的低导电性[5]，同时对于传统的酶基传感器，用两性离子包封酶可提高酶的活性和稳定性[6]。PC接枝的3,4—乙烯二氧噻吩(3,4-ethylenedioxythiophene，EDOT)与SB、CB接枝相比，EDOT-PC对细胞粘附以及蛋白质吸附具有最强的抗干扰性[7]。导电聚合物聚EDOT(poly-EDOT,PEDOT)因其高导电性、生物相容性和功能化可行性被应用于各种生物医学领域，成为用于构建柔性传感器的导电聚合物之一。PEDOT的衍生物羟基功能化的EDOT(EDOT-OH)与PEDOT性能类似，但与PEDOT相比，EDOT-OH对基材的附着力更强，这允许构建的传感器在水溶液状态下进行长期实验。

目前，还未有基于PC功能化的导电高分子应用于葡萄糖传感器复杂界面的研究。因此，本文利用EDOT-PC与一定比例的EDOT-OH共聚，同葡萄糖氧化酶(glucose oxidase，GOx)电沉积到金(Au)片上，构建了基于GOx的电化学葡萄糖传感器。GOx电沉积在导电高分子中，与导电聚合物直接接触，当葡萄糖被氧化后产生的电子可以直接被导电聚合物捕获，使得制备的葡萄糖传感器在有着明显抗蛋白粘附的效果上，进一步呈现出良好的葡萄糖检测性能。

1 实验部分

1.1 实验试剂与仪器

电化学工作站(PGSTAT1128N，Netherlands)用于聚合物与酶的共沉积和循环伏安测试，计时—电流测试。石英晶体微天平(quartz crystal microbalance(QCM),Analyzer，瑞典百欧林科技有限公司)用于功能化导电聚合物表面的抗粘附性测试。EDOT-OH购于南京康瑞医药化工有限公司，牛血清蛋白(bovine serum albumin,BSA)和多库酯钠(docusate sodium,DSS)购于Sigma-Aldrich，磷酸缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)与高氯酸锂(LiClO4)购于Aladdin，铁氰化钾(K3[Fe(CN)6])与亚铁氰化钾(K4[Fe(CN)6])均购于安耐吉，GOx与葡萄糖购于探索平台，EDOT-PC委托合成。所用试剂均为分析纯，实验用水为去离子水。

1.2 EDOT-PC单体与沉积溶液的制备

EDOT-PC单体由课题组其他成员合成制备，合成步骤可参考课题组之前的制备方法[8]。首先，以EDOT-OH为起始单体，与2—氯—2—氧—1,3,2—二氧磷杂环戊烷(COP)反应脱去氯化氢(HCl)，生成EDOT-COP，接着EDOT-COP在三甲胺存在的条件下开环加成，非结晶产物通过纯化后，得到EDOT-PC单体。

分别将EDOT-PC单体(16.8 mg)和EDOT-OH单体(17.4 mg)溶于含有100 mmol/L LiClO4和50 mmol/L DSS的水溶液中，然后按照不同的物质的量比(90 % EDOT-PC，80 % EDOT-PC，70 % EDOT-PC，60 % EDOT-PC)分别混合成5 mL的混合溶液，从而制得相应的沉积溶液。

1.3 QCM样品片与葡萄糖传感器的制备

利用电化学沉积法将EDOT-PC-co-EDOT-OH聚合物沉积到QCM片上，用于抗蛋白粘附性能的探索，其沉积路径如图1所示。

图1 EDOT-PC-co-EDOT-OH聚合物的电沉积路径

将电解槽清洗干净，用氮气吹干，用移液枪吸取5 mL沉积液加入其中，取出准备好的QCM片，以QCM片为工作电极，铂网作为对电极，水相电极为参比电极进行电化学聚合。扫描电势范围为-0.600～1.046 V，扫描圈数为15圈。聚合完成后，取出QCM片，并立即用去离子水快速轻轻冲洗，氮气吹干，进行抗蛋白粘附性测试。

将GOx(10 g/L)分散于1.2节中制备出的沉积液中，用金片作为工作电极，进行电沉积，利用聚合物的包络作用将GOx包裹于其中，构建出葡萄糖传感器，如图2所示。

图2 葡萄糖传感器制备

2 结果与讨论

2.1 功能化导电聚合物表面的抗粘附性测试

将沉积后的QCM晶片进行表面抗粘附性测试。使用QCM仪器测试这些样品表面对BSA的抗粘附性，并用空白的金片空白样品进行对比。取沉积好的QCM晶片放入QCM仪器中，使用微型泵抽取PBS缓冲液，以30 μL/min的速率流动PBS缓冲液，直至晶片表面达到稳态后(数据基线保持稳定)，开始记录数据，以相同速率流动PBS缓冲液900 s，接着换入含BSA(1 g/L)的PBS溶液保持相同流速至2 800 s，重新换入PBS缓冲液，去除掉粘附不牢固的BSA，4 200 s后停止实验，记录数据。对照组空白金片亦重复相同流程。

EDOT-PC-co-EDOT-OH与对照组的抗蛋白粘附的测试结果如图3所示(90 % EDOT-PC难以聚合到QCM片表面，因此不做讨论)。

图3 EDOT-PC-co-EDOT-OH与空白对照组的抗蛋白粘附性能测试

由图3可知，与QCM沉积的导电聚合物的相比之下，纯金片空白样品的频率下降了30 Hz左右，说明该样品表面粘附了大量蛋白，随着EDOT-PC单体的比例不断升高，样品下降的频率越小，说明EDOT-PC-co-EDOT-OH抗蛋白粘附效果越来越好，并证明EDOT-PC具有良好的抗蛋白粘附作用，在EDOT-PC含量达到80 %时，样品的频率下降到达最小(低于5 Hz)，因此，在后续实验中均采用了此共聚比例。

2.2 葡萄糖传感器的电化学性能

由上述可知EDOT-PC含量达到80 %时聚合物的抗蛋白粘附性最好，因此，取含有比例为80 % EDOT-PC单体的沉积液与10 g/L的GOx共沉积在金片上，构建出葡萄糖传感器。在-0.600～1.046 V电压下，采用三电极体系，用循环伏安法进行电化学聚合，其聚合曲线如图4(a)所示，从中选取了第1圈，第5圈，第10圈，第15圈的聚合曲线进行对比。随着圈数的不断增加，氧化电流也随之升高，说明导电聚合物的厚度也在逐渐增加，而沉积在聚合物中的GOx也就更多。在0.75 V的电压下，将不同聚合圈数的传感器浸没于同一葡萄糖浓度(5 mmol/L)的PBS溶液进行电化学检测，结果如图4(b)所示。随着聚合圈数的增加，检测到葡萄糖传感器的电流变化强度也随之增加，但是，当聚合圈数过多时，会导致聚合物不稳定，容易从金片上脱落，因此，选择了15圈作为最优聚合圈数。

图4 葡萄糖传感器的电化学性能测试结果

2.3 葡萄糖传感器的电化学响应

在最佳实验条件下，用计时—电流法评估了葡萄糖传感器对葡萄糖的响应。在0.75 V的电势下，对传感器进行不同葡萄糖浓度(0.05～21)mmol/L的检测，其检测结果如图5所示。从图5(a)中可以看出，葡萄糖浓度越高，EDOT-PC-co-EDOT-OH构建的葡萄糖传感器的电流响应越大，且该传感器有着较宽的线性范围：(0.05～21)mmol/L。由图5(b)可知，该传感器对葡萄糖浓度响应的判定系数(R2)非常接近1，进一步说明传感器对葡萄糖有着良好的响应。

图5 葡萄糖传感器对不同浓度葡萄糖的电化学响应

2.4 葡萄糖传感器的抗蛋白粘附性能

在能够成功检测到不同浓度的葡萄糖信号基础上，为了进一步说明该传感器能够用于实际汗液中葡萄糖的检测，本文配制了含有1 g/L BSA的葡萄糖(10 mmol/L)PBS溶液作为检测液，在0.75 V的电压下，进行传感器抗蛋白粘附性能的测试。同时，未含BSA的同浓度葡萄糖PBS溶液作为对照组，比较了葡萄糖传感器对添加了BSA和未添加BSA的葡萄糖溶液的响应信号强度。响应结果如图6所示，从图中可以看出，在添加葡萄糖溶液后，传感器在2种状态下均有着明显的信号响应，在界面稳定之后，二者响应信号几乎一致，说明传感器具有良好的抗蛋白粘附性能。

图6 葡萄糖传感器抗蛋白粘附性能测试

3 结 论

本文利用共沉积法将葡萄糖氧化酶包裹在EDOT-PC-co-EDOT-OH的三维网络里，共同沉积到金片上，构建出电化学葡萄糖传感器。该方法能够使得葡萄糖氧化酶和导电聚合物直接接触，进行快速的电子传递。该传感器不仅对葡萄糖有着良好的电化学响应(0.05～21)mmol/L，且当EDOT-PC与EDOT-OH单体物质的量比为 4︰1时，传感器具有优异的抗蛋白粘附效果。因此，该电化学葡萄糖传感器可满足在汗液中检测葡萄糖的需求，并为柔性可穿戴汗液传感器的构建提供了一定技术基础。