厌氧氨氧化工艺处理不同抗生素废水的性能比较

赵培植 ZHAO Pei-zhi；冯丹 FENG Dan；万家秀 WAN Jia-xiu

（兰州资源环境职业技术大学，兰州 730021）

0 引言

现阶段，虽然我国已经有效遏制了有机污染物，但是在部分水体中仍然有水体富营养化现象存在。导致这种现象出现的原因主要是因为污水处理厂处理后的污水没有满足相关的总氮和氨氮标准。我国在处理污水方面，随着国家不断提升对于出水水质的要求，传统污水处理技术存在的也越来越突出。在这种情况下，厌氧氨氧化工艺应运而生，得到了广泛的应用。厌氧氨氧化工艺具有低成本、高脱氮效率、少污泥产量、无须曝气等优势[1]。在本文中，将以污水中存在较为广泛的OTC和SMX为研究对象，分别考察其在各种暴露时间和浓度下影响厌氧氨氧化胞外聚合物分泌、生物膜活性以及各种微生物生长情况，与在各种环境中OTC和SMX所拥有的浓度相结合，在本次研究中将使用1-1000μg/L的浓度，并且明确这两种抗生素能够发挥的作用，希望能够为相关人员开展工作提供一定支持。

1 实验设计

1.1 实验方法 选择两个一致的厌氧氨氧化滤柱，随机完成1#和2#的标注。本次研究使用的是2L体积的滤柱，水是沿着从下向上的方向穿过滤柱，持续运行。在滤柱内部只有火山岩填料，填料为7mm左右粒径，研究中所用的水为人工配置，需要在其中加入碱度、亚氮以及氨氮，加入剂量为前者1000mg/L，后两者50mg/L，在配制时分别使用NaHCO3、NaNO2、（NH4）SO4，并且添加MgSO4、KH2PO4、CaCl2，以及微量元素1ml/L，进水后约拥有7.8的pH，4h的HRT。在1、10、100、1000μg/L实验浓度的抗生素中放入两个厌氧氨氧化滤柱生物膜分别完成短期（6h）和长期（22d）暴露，完成对其EPS、微生物活性的测量。

1.2 测量活性 在开展研究时需要先明确两个生物滤柱原有的生物膜活性，从而在后续研究中将其作为对比对象。然后两个生物滤柱需要分别长期和短期暴露于各种浓度的抗生素中，在每次完成暴露后都需要准确测量其活性。在本次研究中的流程为：在火山岩填料中取下生物膜10mg左右，将其放在10ml的离心管中，使用人工配水连续清洗三次，然后再添入适当的人工配水，保证水位位于10mL处，在恒温震荡床上完成离心管放置[2]。设置25℃的反应温度，6h的反应时间，拥有8.0的pH，取出反应始末的水样分别完成硝氮、亚氮、氨氮的测定，完成厌氧氨氧化活性计算。同时测定三个离心管，以平均值为最终结果。

1.3 测定溶解性微生物产物和EPS在这个环节中较为重要的内容就是EPS提取：首先对生物膜样品5ml开展离心处理，处理规范为时间15min，每分钟8000r，进行上清液提取，并完成溶解性微生物产物（SMP）保存；在磷酸缓冲溶液中离心沉淀和悬浮，持续进行3min的40kHz超声处理；准备80℃的水将混合物放入其中，并连续完成30min加热，每加热10min需要摇匀；对悬浮液进行离心处理，处理规范同生物膜样品离心处理，通过上清液完成EPS测定，剩余物质完成污泥质量测定。在500nm波长处使用Folin-phenol法完成提取液中蛋白质（PRO）的测定，在525nm波长处使用蒽酮法完成提取液中多糖（PS）的测定[3]。

2 结果与讨论

2.1 短期和长期暴露中抗生素影响厌氧氨氧化活性的情况 在不同浓度的两种抗生素中暴露6h和22d厌氧氨氧化生物膜后得出了如表1所示的结果。当OTC抗生素并未与1#生物膜接触时，其拥有14.6mg/（h·g SS）的SAA，而在1μg/L的OTC中完成短期暴露后，测定其拥有14.5mg/（h·g SS）的SAA，与未暴露的SAA之间只存在较小的差异，证明厌氧氨氧化生物膜在1μg/L的OTC中短期内不会受到较大影响。当1#生物膜短期暴露于10、100、1000μg/L的OTC中后，在不断增加OTC浓度的过程中SAA分别为12.2.12.0和11.6mg/（h·g SS），SAA呈现逐渐降低的趋势。整个结果证明，当OTC浓度在10μg/L时会在短期内严重抑制厌氧氨氧化生物膜（p<0.05），以此为前提在抗生素拥有越来越高浓度的过程中，虽然一直都发挥着抑制作用，但是抑制作用的强度却使用保持在相同的范围。由此可知，10μg/L是OTC短期抑制厌氧氨氧化的阈值。1#厌氧氨氧化滤柱在1μg/L的OTC中进行22d的长期暴露后，测定其拥有14.5mg/（h·g SS）的SAA，与短期暴露相比拥有相同的SAA值，证明在OTC浓度为1μg/L时，其对厌氧氨氧化生物膜拥有相同的长期作用和短期作用，都只会在较小程度上影响微生物活性。而在长期暴露于10μg/L的OTC中后，也能够对厌氧氨氧化生物膜起到抑制效果，测定其拥有13.3mg/（h·g SS）的SAA。需要注意的是，与短期作用相比，该SAA值更高，可以确定在暴露时间较长时，厌氧氨氧化生物膜适应OTC的能力也在不断提升，导致OTC在生物活性方面所发挥的作用变得越来越不明显。而在100μg/L的OTC长期暴露后中，不仅对SAA没有起到抑制效果，而且起到了相反效果使其达到15.1mg/（h·g SS）[4]。与短期暴露相比存在完全相反的结果，说明随着厌氧氨氧化生物膜在OTC中暴露的时间越来越长会不断增强其适应性。然后在1000μg/L的OTC中，长期暴露后会在很大程度上降低SAA，最终得到了11.1mg/（h·g SS）的测定值，有统计学意义。说明OTC此时已经发挥了最大的抑制作用，明确了其长期抑制阈值为1000μg/L。2#厌氧氨氧化滤柱生物膜在SMX中短期暴露前，拥有14.5mg/（h·g SS）的SAA，而在短期暴露于1μg/L的SMX中后，会在较小程度上降低SAA，测定值为14.3mg/（h·g SS），之后在短期暴露于10、100、1000μg/L的SMX中后，将分别降低SAA至13.8、13.7.13.1mg/（h·g SS），在实验浓度范围内，虽然在不断增加SMX浓度时会逐渐降低SAA，但是存在不够显著的整体降低情况，这证明厌氧氨氧化生物膜对SMX拥有较强的抵抗性。在长期暴露于SMX中后，所得的SAA值分别为1μg/L时为14.8、10μg/L时为14.3、100μg/L时为14.1、1000μg/L时为13.6，单位为mg/（h·g SS）。当SMX浓度为1μg/L时会轻微增加SAA，因为短期抑制作用并不明显，所以没有从抑制转变为适应的过程。相关的研究结果证明，当有机物的浓度较低时对高效稳定地运行厌氧氨氧化有利。所以，产生这种现象的原因可能是厌氧氨氧化生物膜拥有较高的SMX抗性，另一方面由于SMX对反硝化起到了诱导作用使脱氮性能得到了提升。在SMX浓度不断提升的过程中，在长期暴露后厌氧氨氧化生物膜均存在轻微降低的表现，在不同浓度下与短期暴露相比拥有相近的SAA降低程度。这个结果证明在长期作用和短期作用下，在SMX的实验浓度中只会在较小程度上影响厌氧氨氧化，其抑制作用并不明显[5]。

表1 短期和长期暴露中抗生素影响厌氧氨氧化活性的情况 （mg/（h·g SS））

2.2 抗生素影响胞外聚合物的情况EPS与微生物细胞拥有非常相似的主要成分，其主要分为两大类，分别为PS和PRO，其能够在细胞完成营养吸收的过程中发挥重要作用，同时能够使细胞在一定程度上免受有毒物质和杀菌剂的危害。

如表2所示，在1μg/L的OTC中长期暴露1#反应器的生物膜后，拥有较慢的微生物响应速度，只会有较少的EPS分泌，并且会显著降低多糖和蛋白质，证明在这种环境下微生物能够正常生长，其生长情况较为稳定。而在使用10μg/L的OTC时，会在很大程度上增加EPS，特别是在蛋白质方面，会完成从32.6至85.49mg/g SS的迅速提升，证明微生物受到了毒性抑制。当处于拥有抗生素的环境中，正常情况下微生物的EPS分泌量会增大。之后随着OTC浓度越来越高，将会再次显著增加EPS的量，证明借助大量EPS的分泌微生物对OTC逐渐适应，也在渐渐地恢复活性。当使用1000μg/L的OTC时，将会严重抑制微生物，导致微生物大量死亡，也会逐渐降低其分泌的EPS。但是需要注意的是，在不断增加OTC浓度的过程中，也会不断提升SMP的含量，证明生物膜中进入了一些死亡微生物的产物，使微生物拥有反硝化的条件，反而能够使微生物拥有更高的活性。另外，也会逐渐降低PS/PRO的值，证明随着分泌越来越多的PS，是微生物针对毒性的应对措施。

表2 抗生素影响胞外聚合物的情况 （mg/g SS）

微生物在2#反应器中快速反应，在SMX为1μg/L时EPS轻微增加，随着SMX拥有越来越高的浓度能够非常快速地增加EPS，这证明SMX能够得到厌氧氨氧化生物膜的快速反应，即使SMX的浓度较低也能够对EPS产生刺激，使EPS分泌量增加，能够使有毒物质对微生物的抑制情况得到降低[6]。所以在作用持续时间较长的情况下，SMX对SAA的影响显著程度不足。但是需要注意的是，在持续降低SMP中PRO/PS值的过程中，这可能是厌氧氨氧化均对于SMX的一种应对措施，通过提升溶解性多糖分泌，来为细胞提供保护，与OTC相比拥有相同结果。相关学者在研究过程中将1mg/L浓度的SMX放入两个反应器中，在存在EPS保护的基础上，在145h后微生物的OUR值降到了95mg/（L·H）；而当EPS保护不存在时，微生物降低到10mg/（L·H）以下的OUR值。这一研究结果也进一步证实了这一观点，当微生物与SMX接触后能够完成EPS的快速分泌，能够对毒性抑制起到抵抗作用。

2.3 脱氮功能微生物的丰度变化 通过有效对比Silva数据库，得到存在水平差异的微生物分类。在门分类水平方面，在不同阶段两个滤柱的所有生物膜中Proteobacteria都拥有最大的相对丰度，1#滤柱和2#滤柱在0μg/L时分别为57.8%和31.5%，在1μg/L时分别为28.5%和52.3%，在10μg/L时分别为41.3%和55.9%，在100μg/L时分别为31.6%和51.4%，在1000μg/L时分别为41.1%和51.1%。虽然在刚接触OTC时1#生物膜大幅度减少了29.3%的Proteobacteria丰度，但是随后丰度渐渐提升，并且始终处于较高的水平。而在与SMX接触后，2#生物膜不但没有降低Proteobacteria丰度，反而提升情况较为明显，并且能够在浓度不同的情况下处于稳定状态，这种情况证明了在与SMX接触后2#生物膜的稳定性。其次，拥有较高相对丰度的门为Planctomycetes，1#滤柱和2#滤柱在0μg/L时分别为19.0%和15.0%，在1μg/L时分别为25.7%和23.5%，在10μg/L时分别为12.3%和17.2%，在100μg/L时分别为41.5%和16.4%，在1000μg/L时分别为20.7%和12.6%。与相关的研究相结合可知，在自养脱氮系统中广泛存在这两个门的微生物。生物膜在与SMX接触后，在增加Proteobacteria的过程中可能会使其抗生素耐药性不断提升。在抵抗抗生素的机理方面主要是诱导失活的酶或者可以编码的抗生素改性以及对细菌细胞中抗生素靶点的突变进行诱导等。由于在OTC中厌氧氨氧化能够实现自我适应，所以泵出机制可能是厌氧氨氧化能够抵抗OTC作用的主要原因，而降解作用是抵抗SMX的主要原因。

通过分析属水平的微生物分类结果可知，在种类不同浓度不同的抗生素中长期暴露后，会在很大程度上改变厌氧氨氧化微生物生物膜的组成。在厌氧氨氧化中AAOB属于功能微生物，在1#生物膜中AAOB功能菌中的Candidatus Kuenenia属于优势微生物，在OTC浓度不同时期相对丰度的变化幅度较大，在与OTC刚接触时AAOB拥有刺激强化作用，AAOB相对丰度实现了从16.4%到23.4%的提升，当OTC到达10μg/L的浓度时抑制作用再次出现，当OTC到达100μg/L的浓度时进一步增强，在OTC到达1000μg/L的浓度抑制作用再次出现。而当生物膜暴露在浓度不同的SMX中时，分别拥有13.85%、20.19%、14.31%、14.15%和9.43%的相对丰度，出现先提升后降低的情况，这证明在抗生素中AAOB均存在先增强后抑制的情况。在这个过程中需要注意的是，在与抗生素接触后，都有反硝化菌Denitritisoma在两个反应器中被诱导出来，并且在变化趋势方面存在差异。1#滤柱中，反硝化菌只受到OTC较慢的诱导，只有在达到1000μg/L的OTC浓度时其增殖情况才变得非常明显，在很大程度上提升了相对丰度，而在此时已经开始抑制AAOB，之所以会增加反硝化菌Denitritisoma可能是因为在分解微生物死亡残体的过程中有有机质产生，从而对发生硝化反应起到了促进作用。与之相反，在SMX借助2#生物膜后反硝化菌立刻被诱导出，在不同阶段反硝化菌Denitritisoma分别拥有0.01%、3.31%、15.02%、10.52%和14.03的相对丰度，相对来说拥有较高的比例。反硝化菌能够实现对SMX的充分降解并且能够对死亡微生物残体进行利用，能够使厌氧氨氧化生物膜在一定程度上免受SMX的毒性，所以2#滤柱始终为较轻的抑制水平。

3 结论

①在1000μg/L的SMX和OTC中厌氧氨氧化生物膜6h和22d暴露结果表明，厌氧氨氧化活性会在较大程度上受到OTC的影响，且对于100μg/L以下浓度的OTC厌氧氨氧化菌拥有一定的适应性，而厌氧氨氧化在SMX的短期和长期暴露中均不会受到显著影响。

②与OTC相比，SMX能够得到厌氧氨氧化生物膜更快的响应，能够实现EPS分泌量快速增加。在分泌大量的EPS后能够为厌氧氨氧化菌提供保护，使SMX的毒性抑制得到降低。

③在脱氮功能微生物的丰度变化方面，在加入SMX后会大量增殖反硝化菌，其与厌氧氨氧化菌的脱氮会共同完成并使SMX降解，所以SMX只会在较小程度上影响生物膜脱氮性。另外，在抗生素响应方面AAOB相对丰度会存在先增强后被抑制的情况。

所以，厌氧氨氧化能够对拥有微量SMX的废水进行有效处理，在开展含OTC废水的处理工作时，需要与长期驯化相配合。