IL-18BP 对创伤性颅脑损伤大鼠焦虑样行为的改善作用及其机制

李妍 齐曼曼 缴宝杰 李春雷 王春雷 常玉林

血脑屏障受损、灌注不足、炎症因子释放等原因均会造成创伤性颅脑损伤（TBI）患者预后不佳，存活患者相关神经功能的恢复是目前的治疗难题［1］。研究显示TBI 或不全脑缺血再灌注损伤后的大鼠会出现长期且严重的情绪障碍如焦虑、抑郁等［2-3］。IL-18 是IFN-γ 诱导因子，是一种多效性辅助性T 细胞1 型促炎因子［4］。大脑对IL-18 信号尤为敏感，因为中枢神经系统中多种类型的神经细胞表达IL-18 的受体，参与调节TBI 后的神经细胞焦亡［5-6］。IL-18 结合蛋白（IL-18BP）是IL-18 的天然抑制剂，在正常情况下，足够的IL-18BP 使游离IL-18 保持低水平状态［7］。但在某些炎症性疾病中，IL-18 过量产生和释放使IL-18 与IL-18BP 之间的平衡被破坏，导致病理性炎症的发生［8］。但是IL-18BP 对TBI 后神经功能恢复的影响以及相关机制至今尚无定论。因此，本研究拟探究IL-18BP 在TBI 大鼠焦虑样行为中的作用及机制，揭示TBI 对神经系统损伤的潜在机制和治疗靶点，为临床治疗提供科学依据。

材料与方法

一、材 料

1.实验动物

本研究实验动物为7～8 周龄、体重250～300 g的清洁级雄性SD 大鼠72 只（辽宁长生生物技术股份有限公司）。本实验均按照本院动物护理与使用委员会的标准进行。本研究经本院动物评审委员会批准［伦理批准文号：2021-072-02（z）］。

2.主要试剂

神经元核抗原抗体（NeuN）鼠抗单克隆抗体（英国Abcam 公司）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）鼠抗单克隆抗体（上海碧云天生物技术有限公司）、NOD 样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NLRP3）兔抗多克隆抗体（北京索莱宝科技有限公司）、IL-18 兔抗多克隆抗体（上海碧云天生物技术有限公司）、活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1（cl-Caspase-1）兔抗多克隆抗体（英国Abcam公司）、消皮素D（GSDMD）兔抗多克隆抗体（美国Cell Singnaling 公司）、大鼠IL-18 ELISA 试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）。

二、方 法

1.动物分组及干预方法

将72 只大鼠按照随机数字表法分为3 组各24只：假手术组（Sham 组）、TBI 组、TBI+IL-18BP组。TBI+IL-18BP 组大鼠在TBI 后即刻经鼠尾静脉注射IL-18BP 1.5 mg/kg（溶于双蒸水，批号：HYP7211，美国MCE 生物科技公司）。

2. TBI 模型建立

将大鼠麻醉后固定于装有加温装置的操作台上，将大鼠头固定于脑立体定位仪（上海玉研科学仪器有限公司）上，头颅皮肤消毒后，沿正中切开皮肤，剥离骨膜，暴露右顶骨。用牙科钻在前囟点（双眼连线与双耳连线前1/3）后3.5 mm，中线右侧2.5 mm 处钻一直径为6 mm 的骨窗，用20 g 砝码于25 cm 高度坠落致大鼠TBI。TBI 组与TBI+IL-18BP 组按上述操作，Sham 组只开骨窗，不予砝码打击即进行缝合。

3.行为学检测

3.1 旷场实验

每组抽取12 只大鼠于模型制备后第30 日进行旷场实验。将黑色正方形敞箱（60 cm× 60 cm×40 cm）分割成16 个相等的方格。实验时将大鼠从敞箱的同一位置轻柔地放于箱内，适应1 min。记录大鼠5 min 内的运动距离、中央区进入次数及中央区滞留时间。

3.2 高架十字迷宫检测

大鼠在旷场实验结束后休息2 h 再进行高架十字迷宫检测，十字迷宫由2 个闭合臂（50 cm×10 cm×40 cm）和2 个同样大小的开放臂组成，彼此夹角90°。记录大鼠被放入高架十字迷宫5 min内的运动轨迹。统计每只大鼠在迷宫中运动总距离、开放臂进入次数百分比以及滞留时间百分比。开放臂进入次数百分比=开放臂进入次数/（开放臂进入次数+闭合臂进入次数）；开放臂滞留时间百分比=开放臂滞留时间/（开放臂滞留时间+闭合臂滞留时间）。

4. ELISA 检测

模型制备后第30 日，检测大鼠血清和脑脊液中IL-18 浓度，参照IL-18 ELISA 试剂盒（批号：EK0592，武汉博士德生物工程有限公司）说明书进行操作。

5.免疫荧光检测

每组抽取6 只大鼠，于取血结束后取其脑组织，固定48 h 后制作石蜡切片。石蜡切片经过脱蜡、水化、抗原修复后封闭。在切片上滴加一抗NeuN（1∶200）、GFAP（1∶200）、NLRP3（1∶200）、IL-18（1∶200），切片至于4℃黑盒内过夜。次日，切片用磷酸盐缓冲液洗涤。滴加Cy3 标记山羊抗鼠IgG （1∶500）和FITC 标记山羊抗兔IgG （1∶500）并于37℃孵育1 h。滴加一滴4,6-二脒基-2-苯基吲哚染液5 min，双盲法荧光显微镜下观察，每张切片观察5 个视野，计算GFAP 和NeuN 的阳性细胞数，NLRP3/GFAP、IL-18/GFAP 双阳性细胞百分比即星形胶质细胞焦亡的情况。

6.蛋白免疫印迹法检测

每组抽取6 只大鼠，于取血结束后取下其杏仁核区。用蛋白印迹及IP 细胞裂解液提取杏仁核区的细胞总蛋白，用BCA 法测蛋白浓度。每泳道上样30 μg 蛋白，分别用12%（cl-Caspase-1、N-GSDMD） 和8%（NLRP3） 的SDS- 聚 丙 烯酰胺凝胶恒流电泳，恒压转膜至聚偏二氟乙烯（PVDF） 膜 上。 加 入NLRP3（1∶1000）、cl-Caspase-1（1∶1000）、N-GSDMD（1∶1000）一 抗4℃孵育PVDF 膜过夜。次日，TBST 洗膜后加入山羊抗兔IgG 二抗（1∶1000）25℃孵育1 h。ECL 发光。应用Image-Pro Plus 6.0 分析各条带的灰度值，以GAPDH 作为内参。目的蛋白与内参的灰度比值为目标蛋白的相对表达量。

三、统计学处理

采用SPSS 20.0 和GraphPad Prism 9.0 处理数据，实验数据均符合正态分布，以表示。组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验。P ＜ 0.05 为差异有统计学意义。

结 果

一、IL-18BP 对TBI 大鼠焦虑样行为的影响

旷场实验显示，与Sham 组相比，TBI 组、TBI+IL-18BP 组大鼠中央区进入次数与中央区活动时间均减少（P 均＜ 0. 05）。与TBI 组相比，TBI+IL-18BP 组大鼠中央区进入次数与中央区活动时间均增加（P 均＜ 0.05）。见表1。

表1 大鼠术后第30 日旷场实验结果（x±s）

高架十字迷宫实验显示，与Sham 组比较，TBI组、TBI+IL-18BP 组大鼠开放臂进入次数百分比与开放臂运动时间百分比均减少（P 均＜ 0. 05）。与TBI 组相比，TBI+IL-18BP 组大鼠开放臂进入次数百分比与时间百分比均增加（P 均＜ 0. 05）。见表2。

表2 大鼠术后第30 日高架十字迷宫结果（x±s）

二、大鼠杏仁核区神经元、星形胶质细胞数量变化

3 组大鼠TBI 后杏仁核区神经元的数量无明显差异（F = 0.230，P = 0.950），但星形胶质细胞的激活（GFAP 阳性）差异有统计学意义（F =285.000，P ＜ 0.001）。 与Sham 组 相 比，TBI 组、TBI+IL-18BP 组大鼠星形胶质细胞的激活数量增加；与TBI 组相比，TBI+IL-18BP 组大鼠的星形胶质细胞激活数量减少（P 均＜ 0. 05）。见图1～2。

图1 大鼠术后第30 日杏仁核区神经元与活化的星形胶质细胞（免疫荧光染色）

三、大鼠血清、脑脊液中IL-18 的浓度

与Sham 组大鼠相比，TBI 组、TBI+IL-18BP组大鼠血清和脑脊液中IL-18 的浓度升高；与TBI组大鼠相比，TBI+IL-18BP 组大鼠的IL-18 浓度降低（P 均＜ 0. 05）。见表3。

表3 大鼠术后第30 日血清和脑脊液中的IL-18 浓度（x±s） 单位：ng/mL

四、大鼠杏仁核区NLRP3/GFAP、IL-18/GFAP双阳性星形胶质细胞百分比

与Sham 组大鼠相比，TBI 组、TBI+IL-18BP组大鼠杏仁核区NLRP3/GFAP 和IL-18/GFAP 双阳性星形胶质细胞数量均增加；与TBI 组相比，TBI+IL-18BP 组大鼠杏仁核区双阳性星形胶质细胞数量减少（P 均＜ 0.05）。见图3～4。

图3 大鼠术后第30 日杏仁核区NLRP3/GFAP、IL-18/GFAP 双阳性星形胶质细胞（免疫荧光染色）

五、杏仁核区焦亡相关指标的变化

3 组大鼠术后第30 日杏仁核区NLRP3、cl-Caspase-1、GSDMD 的表达量差异均具统计学意义（F 分 别 为1195.000、265.700、613.500，P 均＜0.050）。与Sham 组相比，TBI 组、TBI+IL-18BP 组杏 仁 核 区NLRP3、cl-Caspase-1、N-GSDMD 的 表达均上调；与TBI 组相比，TBI+IL-18BP 组杏仁核区NLRP3、cl-Caspase-1、GSDMD 的表达均下调（P 均＜ 0.05）。见图5。

图5 大鼠术后第30 日杏仁核区NLRP3、cl-Caspase-1、N-GSDMD 的相对表达量

讨 论

图2 大鼠术后第30 日杏仁核区神经元与星形胶质细胞数目统计图

TBI 是世界范围内致残与致死的主要原因之一，给全球公共卫生带来了巨大的威胁，给社会造成了沉重的经济负担［9］。TBI 会导致长期的情绪紊乱，如抑郁和焦虑［10］。本研究结果显示大鼠TBI后出现焦虑样行为，与既往研究结果一致。

图4 大鼠术后第30 日杏仁核区NLRP3、IL-18 阳性星形胶质细胞比例统计图

TBI 后损伤相关分子模式（DAMP）等内源性介质在局部和全身释放，被先天免疫系统识别后可激活NLRP3，随后NLRP3 通过N 端的PYD 结构域募集前Caspase-1 分子，前Caspase-1 二聚体自我蛋白酶解，形成p10 或p20 片段的裂解碎片，激活前炎症因子IL-1β 和IL-18，也可通过激活GSDMD 来诱发细胞焦亡［11-13］。细胞 焦 亡与TBI 的神经功能恢复有着紧密的关系［14-15］。本研究中TBI大鼠杏仁核区NLRP3、cl-Caspase-1、N-GSDMD 表达均上调，与既往研究结果一致。杏仁核是一种边缘大脑结构，对情绪调控、学习记忆能力至关重要［16］。既往有研究证实TBI 后星形胶质细胞激活明显增多［17-18］。本研究中TBI 大鼠杏仁核区星形胶质细胞激活增多，星形胶质细胞内NLRP3 与IL-18表达上调，提示TBI 可诱发杏仁核区星形胶质细胞焦亡，此病理改变可能与大鼠的焦虑样行为相关。

有研究报道IL-18 参与调节TBI 后大脑神经细胞焦亡［7］。本研究中TBI 大鼠血清和脑脊液中IL-18 浓度上调，IL-18 阳性的星形胶质细胞表达亦上调。IL-18BP 为IL-18 特异性抑制剂，可减轻失血性休克小鼠的焦虑样行为［19］。本研究中TBI大鼠注射IL-18BP 后焦虑样行为改善，且IL-18BP减少了TBI 大鼠杏仁核区星形胶质细胞的激活，NLRP3、IL-18 阳性的星形胶质细胞数量减少，杏仁核区焦亡相关蛋白的表达也下调。

本研究的不足之处：只验证了杏仁核区的变化，对于情绪控制相关的其他脑区如腹内侧前额叶皮质、边缘系统中边缘皮层内的海马和扣带回、伏隔核等均未进行研究；在TBI 后诱发的炎性反应中只关注了星形胶质细胞的变化，缺少小胶质细胞、少突胶质细胞变化的研究。本研究团队将在下一步实验中进一步观察。

综上所述，IL-18BP 能一定程度减轻TBI 大鼠的焦虑样行为，可能与减轻星形胶质细胞的焦亡密切相关。