微柱凝胶卡式法检测新生儿ABO溶血三项的临床应用

孙月娥 何烁晴 吴永美

新生儿溶血病（Hemolytic disease of newborn，HDN）是由母体血型和胎儿血型之间的异常相互作用引起的胎儿或新生儿的免疫性溶血病［1］。胎儿红细胞进入母体循环，导致母体产生相应的IgG 抗体，通过胎盘作用于胎儿红细胞，导致不同程度的溶血［2］。临床表现包括胎儿水肿、新生儿黄疸、贫血、早产或早死、肝脾肿大等后遗症［3］。我国最常见的原因是母婴ABO 血型不合，HDN 的发病率正不断升高，国外Rh 血型不合的发病率偏高［4-5］。因此，早期检测HDN 有助于临床医生对疑似病例进行正确筛查并予以及时治疗，提高新生儿生存质量具有重要的临床意义。HDN 主要通过血清学检测结果进行判定，即新生儿ABO 及Rh 血型鉴定及溶血三项试验［6］。溶血三项包括直接抗人球蛋白试验、游离抗体试验、放散试验，当出现不同时阳性时以放散试验阳性为HDN 诊断标准。本研究选取本院疑似HDN 新生儿102 例作为研究对象，探讨采用微柱凝胶卡式法在放散试验中联合热放散及酸放散试验对新生儿ABO 溶血病进行检测，旨在分析联合检测在新生儿ABO 溶血病的应用效果。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2018年1月至2022年1月合肥市第八人民医院的疑似患有HDN 102 例作为研究对象。其中男49 例，女53 例；出生时间平均（6.14±2.03）d。纳入标准：①新生儿在出生7 d 内均出现黄疸、贫血、血红蛋白降低、高胆红素血症等临床症状；②溶血三项检测中至少有一项结果呈阳性。排除标准：①患有乙型肝炎病毒等继发性疾病；②新生儿家属拒绝参加本研究。本研究经医院伦理委员会审核并批准，所有新生儿监护人均知情本研究并签署同意书。

1.2 检测方法

1.2.1 试剂与仪器

标准抗A、B 血清试剂（厂家：上海血液生物医药有限公司）、标准A、B、O 红细胞（厂家：上海血液生物医药有限公司）、ABO 正反定型及Rh 血型定型试剂卡（厂家：深圳爱康试剂有限公司）、多特异性抗人球蛋白试剂、单特异性抗-IgG、单特异性抗-C3（厂家：深圳市爱康试剂有限公司）、微柱凝胶检测卡、试剂、37℃免疫微柱孵育器（厂家：深圳市爱康试剂有限公司、江苏力博医药生物技术股份有限公司、长春博研科学仪器有限责任公司）、低速离心机（厂家：深圳爱康生物科技有限公司）、恒温水温箱（厂家：上海医用恒温设备厂）。

1.2.2 血型检测方法

采集所有新生儿2～3 mL EDTA-K2 抗凝全血，3 000 r/min 离心10 min，离心半径为6 cm，分离血清和压积红细胞。

1.2.3 微柱凝胶卡式法

1.2.3.1 直接抗人球蛋白试验 采集静脉血，3 000 r/min 离心10 min，离心半径为6 cm，后分离红细跑，用生理盐水彻底洗涤数次后，制成0.5%红细胞悬液，加入微柱凝胶孔50 μL，2 000 r/min 条件下离心5 min 后观察结果并进行判断，如果红细胞聚集在凝胶带的上部或中部位置，则可认为是阳性。

1.2.3.2 游离抗体试验 在微柱凝胶卡上显示的相应位置加入50 μL A、B、O 红细胞和50 μL 新生儿血清，将上述标本在37℃下孵育约15 min，2 000 r/min 条件下离心10 min 后观察结果并进行判断，阳性结果的判断与直接抗人球蛋白试验相同。

1.2.3.3 放散细胞准备 取标本3 000 r/min 条件下离心10 min，获取血浆层转至另一试管备用；采用生理盐水洗涤剩余的2mL 压积红细胞，3 000 r/min 条件下离心5 min，完成3 次洗涤，分别在2 支试管中添加1 mL 洗涤的压积红细胞，待行热放散和酸放散试验。

1.2.3.4 热放散试验 将1 mL 洗涤的压积红细胞与等体积生理盐水进行混合，并将其在56℃水浴条件下振动约10 min，以2 000 r/min 条件下离心5 min，离心半径为6 cm，取上清液进行检测。

1.2.3.5 酸放散试验 将1 mL 洗涤的压积红细胞与等体积溶液I 进行混合后上下颠倒试管4 次，以3 000 r/min 条件下离心1 min，离心半径为6 cm，将上清液转移至另一试管。在放散液中加入溶液Ⅱ，待至放散液变为蓝色（即放散液由酸性变为中性）后进行检测。见图1。

1.3 结果判断

1.3.1 试验结果判定［7］

①阳性：通过离心试剂卡表现出红细胞留置于微柱上层或分布在凝胶柱体中。②阴性：通过离心试剂卡表现为微柱底部沉淀红细胞。

1.3.2 HDN 判断标准［8］

溶血三项试验均为阳性即可确诊；如果出现不同时阳性时以放散试验阳性为诊断标准。

1.4 观察指标

分析HDN 血型分布，参照《输血治疗学》［9］的标准对新生儿血型进行鉴定。比较两种放散试验在新生儿ABO 溶血病中的阳性率及凝集强度。

1.5 统计学方法

采用SPSS 22.0 软件进行数据处理，计量资料以（）表示，两组间采用t检验；计数资料以n（%）表示，采用χ2检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HDN 血型分布

102 例新生儿经检测最终84 例确诊为HDN，阳性率达82.35%；其中ABO HDN 阳性率达72.97%（54/74），Rh HDN 阳性率达10.00%（1/10）；74 例ABO 血型不合中，A 型HDN 阳性率达高于B型，但差异无统计学意义（P＞0.05）；10 例Rh 血型不合中，Rh（D）HDN 阳性率达16.66%（1/6），而Rh（E）3 例、Rh（C）1 例，HDN 均为阴性，三者HDN 阳性率差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 HDN 血型分布［n（%）］Table 1 HDN blood group distribution［n（%）］

2.2 两种放散试验在新生儿ABO 溶血病中的阳性率比较

新生儿ABO 溶血病诊断中，热放散试验检出阳性57 例，检出率为44.53%（57/128）；酸放散试验检出阳性78 例，检出率为60.93%（78/128）。酸放散试验在溶血病中的阳性检出率高于热放散试验，差异有统计学意义（χ2=6.911，P＜0.05）。热放散试验联合酸放散试验检出阳性80例，检出率为62.50%（80/128）；单一热放散试验的阳性检出率为44.53%，单一酸放散试验的阳性检出率为92.85%，联合诊断新生儿ABO 溶血病的阳性检出率高于单一热放散试验，差异有统计学意义（χ2=8.306，P＜0.05）；联合检测与单一酸放散试验比较，差异无统计学意义（χ2=0.006，P=0.797）。见表2。

表2 两种放散试验在新生儿ABO 溶血病中的阳性率比较Table 2 Comparison of the positive rate of two kinds of emission tests in neonatal ABO hemolytic disease

2.3 两种放散试验凝集强度分析

热放散试验检测新生儿ABO 溶血病的凝集强度相对集中在+～++，占比68.42%（39/57），酸放散试验凝集强度相对集中在++～+++，占比69.23（54/78）。见表3。

表3 两种放散试验凝集强度分析［n（%）］Table 3 Comparison of agglutination strength of two emission tests［n（%）］

3 讨论

ABO HDN 可致新生儿贫血、高胆红素血症等临床症状，尽管ABO HDN 的临床后果不如Rh HDN 严重，但发生率远远高于后者，如果不及时治疗，病情严重者也引起核黄疸，对新生儿造成不良影响［10-11］。本研究对疑似患有HDN 新生儿均做了ABO 及Rh 血型鉴定，结果显示，ABO HDN 阳性率达72.97%（54/74），Rh HDN 阳性率达10.00%（1/10），ABO、Rh 血型分布与HDN 阳性率差异无统计学意义。与郭莹莹等［12］的研究一致。

HDN 的发病与母体内IgG 抗体种类和胎儿红细胞表面抗原关系密切，仅有IgG 抗体能经过胎盘进入胎儿体内循环，导致溶血发生。由于胎儿红细胞上的A 位点（抗原决定簇）比B 位点多，因此A 型HDN 发病率普遍高于B 型。本研究也发现A型HDN 阳性率达80.64%（25/31）高于B 型67.44%（29/43），但差异无统计学意义，与薛松等［13］的研究类似。溶血三项包括直接抗人球蛋白、游离抗体及放散试验，能对新生儿血清中是否含有红细胞抗体或红细胞是否已致敏进行准确判定。微柱凝胶卡式法作为一种新的免疫学检测技术，是凝胶柱过滤、抗原抗体反应及离心三种技术的结合，其省略了洗涤步骤，减少了技术误差，有效避免抗人球蛋白抗体被中和而出现假阴性，且所需血清量少，反应灵敏度高，尤其适用于新生儿血清学检测［14］。本研究结果显示，新生儿ABO 溶血病诊断中，热放散试验检出阳性57 例，检出率为44.53%（57/128）；酸放散试验检出阳性78 例，检出率为60.93%（78/128）。酸放散试验在溶血病中的阳性检出率高于热放散试验，差异有统计学意义。热放散试验联合酸放散试验检出阳性80 例，检出率为62.50%（80/128），联合诊断新生儿ABO 溶血病的阳性检出率高于单一热放散试验，差异有统计学意义。提示酸放散试验在新生儿ABO 溶血病的阳性检出率更高，采用两种放散试验联合检测可有效提高阳性检出率，在诊断新生儿ABO 溶血病中具有重要的临床价值。热放散试验在操作过程中要求对红细胞上清液进行一边振摇、一边水浴加热处理，放散抗体数量较少时易出现假阴现象，漏诊率较高，且受试验者操作水平影响，主观影响因素较大。相比之下，酸放散试验通过PH 变化，分解红细胞表层的抗体，大大减少了操作者对检测结果的影响，且操作时间短，临床吻合度高。同时本研究结果显示，热放散试验检测新生儿ABO 溶血病的凝集强度相对集中在+～++，占比68.42%（39/57），酸放散试验凝集强度相对集中在++～+++，占比69.23（54/78）。提示两种放散试验可互补，联合检测能够弥补单一放散试验检测的漏诊问题，有助于临床医师更好地鉴别新生儿ABO 溶血病。

综上，ABO 血型不合的HDN 发生率显著高于Rh 血型不合，热放散试验联合酸放散试验能够弥补单一放散试验检测的漏诊问题，从而提高新生儿ABO 溶血病阳性检出率，在HDN 的早期诊断中起积极作用。