农药环境污染对两栖动物蛙类毒性效应研究进展

明仁月，陈可嘉，李兰英，杨 亚，卢 平

（贵州大学精细化工研究开发中心，贵阳 550025）

农药是农、林、牧业中控制有害生物和调节植物生长的化学药品[1]。研究报道，若不施用农药，水果、蔬菜和谷物产量将分别减少78%、54%和32%[2]。因此，农药在提高全球农作物产量、提供充足的优质食品和缓解贫困等方面做出了重大贡献[3]。据统计，全球每年使用农药约30亿kg，但能有效控制害虫的总量只有1%[4]。大量的农药通过喷洒[5]、径流或渗流[6]等方式广泛分布于环境中，污染了水生和陆地环境，对非靶标生物构成一定的威胁。

两栖动物是维持水生、陆地和农田生态系统的非靶标生物，对平衡生态系统和保障粮食安全具有重要的意义[7]。然而两栖动物皮肤具有渗透性[8]，对环境化学物质较敏感，在水生和陆地栖息地接触农药的风险较高[9]。研究发现环境中的农药会显著影响两栖动物的发育[10]，导致平衡生态系统中两栖动物减少[11]，威胁了两栖动物的种群，削弱了两栖动物在生态系统中的功能。蛙类是常见的两栖动物，它们在食物链中发挥着重要的作用，每年捕食数以亿计的昆虫，是环境健康的重要指标。当污染物影响栖息地时，它们往往是第一批受害者，为生态系统中的敏感生物提供了预警。因此，研究农药对两栖动物的风险具有重要意义。

为了更好地保护两栖动物，实现人类活动和自然的和谐统一，本文根据近年来农药对两栖动物影响研究的文献，将农药对两栖动物的毒性效应进行了总结和分析，为评估农药对两栖动物的风险及农药的合理使用提供科学依据。

1 农药环境污染物对蛙类急性毒性研究

蛙类是农业害虫的主要天敌之一[12]，其典型的发育阶段如图1所示[13-14]。急性毒性试验是评估农药对非靶标生物造成影响的重要手段，通过LC50（半致死浓度）可以快速有效地评价毒性，为长期慢性毒理试验、生殖毒性试验等提供基础数据[15]。当前，国内外学者就农药对蛙类急性毒性试验的数据见表1。

表1 农药对两栖动物蛙类急性毒性试验数据

图1 蛙类典型发育周期

不同类别的农药对两栖动物产生的毒性不同。根据GB/T 31270.18—2014《化学农药环境安全评价试验准则》第18部分“天敌两栖类急性毒性试验”中农药对两栖动物的急性毒性划分，96 h的LC50≤0.1 mg/L为剧毒，0.1＜LC50≤1.0 mg/L为高毒，1.0＜LC50≤10 mg/L为中毒，LC50＞10 mg/L为低毒。

拟除虫菊酯、有机氯、有机磷类杀虫剂对蛙类的毒性大多表现为高毒，与其他发育阶段相比，对蝌蚪阶段的毒性更大；氨基甲酸酯杀虫剂对蛙类毒性研究较少，从文献上看，不同的氨基甲酸酯杀虫剂对蛙类毒性表现不一，灭多威对蝌蚪表现为低毒，甲萘威对成蛙毒性较高；新烟碱杀虫剂对蛙类毒性的研究大多集中在蝌蚪发育阶段，该阶段毒性为低毒，对胚胎和蛙阶段的研究较少；多数除草剂类农药对蛙的胚胎、蝌蚪、蛙发育阶段表现为中毒。杀菌剂品种繁多，结构不一，对非靶标生物有着不同的选择性，对蛙类的毒性研究集中在蝌蚪发育阶段，不同的杀菌剂对蝌蚪表现出显著差异的急性毒性，如肟菌酯对非洲爪蟾蝌蚪表现为低毒，而吡唑醚菌酯对美国牛蛙蝌蚪毒性达到了剧毒。

从毒性数据上发现，①对于同一种两栖动物，同一类型的不同种农药表现的毒性差异很大，如久效磷对Boana xerophylla蝌蚪的毒性为低毒，二嗪磷为中毒，而毒死蜱为高毒。同一农药对不同发育阶段两栖动物体现的毒性也存在着差异，如Roundup-草甘膦（有效成分为异丙胺盐）对非洲爪蟾蝌蚪表现为高毒，对胚胎和成蛙为中毒；硫丹对非洲爪蟾蝌蚪也表现为高毒性，而胚胎为中毒。②手性农药对两栖动物的毒性存在着显著差异，S-联苯菊酯对非洲爪蟾蝌蚪为高毒，而R-联苯菊酯为中毒，但手性农药对两栖动物毒性研究报道较少，应加强对该类农药的关注。多种毒性数据显示，两栖动物幼体阶段比胚胎对环境中的农药更为敏感，这可能是胚胎外层胶膜的存在使其免受化学品的污染[16]。

2 农药环境污染物对蛙类发育的影响

农药在减少害虫造成的作物损失方面发挥着关键作用，然而，残留在环境中的农药对两栖动物的生存造成了一定的危害，对两栖动物各个发育阶段表现出不同程度的损伤。

在胚胎阶段，西维因、硫丹和辛基苯酚降低了河边蝾螈的存活率[47]；百菌清的持续暴露抑制了阿根廷蟾蜍的孵化率，并造成其腹部和尾畸形[48]；百草枯导致蟾蜍发育停滞，头和背部畸形明显[49]。在幼体阶段，噻虫嗪和氯噻嗪抑制了非洲爪蟾蝌蚪体重和体长的发育[50]；暴露于氯氰菊酯仅168 h对蟾蜍产生的畸形指数就达到了5[51]；毒死蜱严重损害了黑眼睑小树蛙口腔及肠的结构[52]，导致捷蛙的骨骼和肌肉缺失，改变了鳃的形态和超微结构，蝌蚪依靠鳃呼吸，而影响鳃的发育会导致其呼吸困难，对蝌蚪健康和体能造成一定的影响[53]；西草净不仅延迟了Silurana tropicalis后肢的发育，还造成尾扭曲严重[54]；阿特拉津的胁迫降低了南方豹蛙发育阶段的生长率，造成按时变态的蝌蚪较少[55]；硫丹的暴露导致了变态后Fejervarya sp.1和F.teraiensisd前后肢的畸形[56]；西维因使南方豹蛙在变态发育过程中有较高的死亡率，且近18%的豹蛙出现了畸形，包括内脏和四肢等[57]，同时农场中发现成年阶段草蛙和湍雨滨蛙的前肢和后肢不完整[58]；毒死蜱、乐果和敌稗的暴露导致沙漏树蛙的脊柱侧弯、后凸，以及水肿和皮肤溃疡等损伤[59]。研究还发现农药对两栖动物妊娠母体有一定的毒性。农药污染池中暴露程度更高的蟾蜍种群长期存在生殖障碍——受精、存活率低等问题[60]。农药对蛙类常见的形态损伤见图2，图中af表示轴弯曲，e为水肿，b为尾畸形，m为头畸形，rbs为体型缩小，ut为尾发育不全[52,54]。

图2 农药胁迫下对蛙类形态常见的损伤

生物生长过程受基因在时间、空间上高度有序表达的调控。农药散播在环境中，可能会干扰两栖动物发育相关基因的表达，影响基因的功能，造成包括畸形在内的各种发育异常。如草甘膦暴露于非洲爪蟾胚胎后，心脏中isl1（胰岛素增强子结合蛋白1）、nkx2.5（心脏特异性同源盒转录因子）、mhca（α-肌球蛋白重链）、actc1（心肌α-肌动蛋白）和tnni3（肌钙蛋白I）表达降低，心脏结构异常，导致心率降低[61]。在有机锡的暴露下，非洲爪蟾甲状腺应答基因trβ（甲状腺激素受体β）、bteb（基本转录元件结合蛋白）、dio2（碘甲腺原氨酸脱碘酶-2）、tshβ（促甲状腺激素β亚基）和slc5a5（溶质载体家族成员5）的表达受到影响，扰乱了甲状腺的信号通路，抑制了甲状腺的发育[62]；在甲萘威的作用下，绿蛙蝌蚪甲状腺的应答基因表达受到抑制，影响了其在mRNA中的丰度分布[63]。

3 农药环境污染物对蛙类行为活动的影响

动物的行为（觅食、社交、交配、捕食、迁徙和躲避）是评价动物及其种群状态的标志[64]。两栖动物具备独特的生理特性，在食物链中有着重要的地位，而农药的广泛使用对其生存、捕食和繁殖造成了一定的影响，进而危害了其种群和生态系统的平衡。

异常旋转和不正确姿势是神经毒性应激的标志之一[65]。在硫丹的暴露下，斑点蛙蝌蚪表现出尾旋转快速、侧卧及背部向下等异常行为[6]；灭多威的暴露使得阿拉伯蟾蜍蝌蚪也出现类似的情况[66]。

食物是动物生长及生理功能的必需品[67]。西维因导致南方蟾蜍蝌蚪进食量减少了40%[68]；唑酰草胺对非洲爪蟾蝌蚪摄食有显著的抑制作用[69]。觅食的减少会导致用于分配储存、繁殖和生长的能量受到限制[70]，对健康造成影响。

游泳模式是评估蝌蚪生态毒理学行为活动的一种典型方式[71]。南方豹蛙蝌蚪游泳的总位移和平均速度随着噻虫胺暴露浓度的增加而显著下降[72]；敌草隆的暴露显著降低了牛蛙蝌蚪的最大速度[44]。在视觉测定和视频跟踪模式下，发现硫丹对非洲爪蟾蝌蚪游泳行为造成了影响，且导致其取食次数降低[73]。草甘膦的暴露降低了捷蛙蝌蚪躲避蜻蜓幼虫的能力[74]；模拟苍鹭攻击的环境，发现暴露于吡虫啉的林蛙难以逃离捕食者的追捕，而没有接触吡虫啉的林蛙会通过移动和跳跃等方式来躲避[75]。

交配行为也会因农药污染物受到影响。接触莠去津的雄性非洲爪蟾睾丸酮降低、繁殖腺变小、喉部发育雌性化，导致交配行为受到影响，从而降低了它们的生育能力[76]。

除此以外，研究表明农药产生的毒性效应可能会干扰两栖动物的自主神经调控，从而影响其行为。2，4-二氯苯氧乙酸能够降低牛蛙蝌蚪的呼吸速率[77]，硫丹的暴露降低了青蛙蝌蚪在水面呼吸的频次[78]，而充足的水面呼吸对于调节两栖动物的血氧有着重要的意义[6]。

4 农药环境污染物对蛙类氧化应激的影响

氧化应激是指体内氧化与抗氧化作用失衡的状态，一般主要是指自由基在体内产生的一种负面作用，是导致衰老和疾病的一个重要因素[79]。自由基会产生氧化应激现象，该现象对脂质、蛋白质、DNA及外源抗氧系统的酶系统和非酶系统都会产生负面影响[80]，如图3所示。

图3 产生氧化应激的自由基途径

丙二醛（MDA）是脂质过氧化反应产生的代谢产物，其含量可反映脂质过氧化水平，即机体细胞受自由基攻击的程度。在噻虫嗪的影响下，中华蟾蜍蝌蚪体内丙二醛含量显著升高，造成了脂质过氧化[33]；随着暴露时间的持续，戊唑醇使黑斑蛙体内MDA含量持续升高[81]。蛋白质羰基是多种氨基酸在蛋白质氧化修饰过程中的早期标志，其含量高低表明蛋白质氧化损伤程度的大小，是衡量蛋白质氧化损伤的主要指标[82]。敌百虫的暴露不仅使Boana curupi蝌蚪体内MDA升高，而且增加了蛋白质羰基的含量，诱导了脂质、蛋白质的氧化损伤[83]。在彗星实验中，根据Endo III sites位点计算分析草甘膦和草膦酸铵对砂质犀角蟾蝌蚪是否造成DNA损伤，结果表明两种农药均造成蝌蚪的DNA损伤，其中草甘膦引起的氧化损伤更为严重[84]。

抗氧化系统主要分为酶类抗氧化系统和非酶类抗氧化系统，其使自由基的产生与消除处于动态平衡状态，是生物体的一种适应性机制。抗氧化酶从不同角度协助清除体内的活性氧（ROS），在抗氧化过程中起着重要的作用[85]。超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）是抗氧化系统的核心组成部分，在防御氧自由基方面起着不可或缺的作用[86]；谷胱甘肽S-转移酶(GST)是一种已知的II相代谢解毒酶，可催化谷胱甘肽（GSH）与外源物质及其代谢产物相结合[87]。热带爪蟾胚胎暴露于低浓度高效氯氟氰菊酯后，随着浓度的增加，SOD和GST活性显著升高，诱导氧化应激[88]；黑斑蛙蝌蚪在高剂量吡虫啉暴露下，体内SOD、CAT、GST活性降低[32]。分析其原因，可能是ROS过度积累，导致这些酶无法抵御高水平的氧化应激，从而失去活性[89]。在阿特拉津和毒死蜱的胁迫下，东北林蛙变态时期肝脏组织中的SOD和CAT活性随着农药剂量的上升而显著下降[90]；非洲爪蟾幼蛙暴露于啶虫脒导致SOD、CAT、GST活性增加[35]；农药诱导的GST和CAT活性存在性别差异，成年雌雄非洲爪蟾暴露于三唑酮及其代谢物三唑醇，发现对雌性血液中SOD的影响大于雄性，与GST和CAT的结果相反[91]。农药的暴露也会改变其他抗氧化酶的活性。GR（谷胱甘肽还原酶）是生物体中去除过量ROS的抗氧化酶，可以促进生物体细胞的健康发育[92]。黑斑蛙蝌蚪暴露于吡虫啉后，GR活性显著升高[93]。T-AOC（总抗氧化能力）是机体抗氧化系统功能状态的综合能力，其大小直接反映机体清除自由基的总体能力[87]，对机体T-AOC的检测可以直观地反映环境化学物质对生物体生理毒性的影响程度。随着啶虫脒和噻虫嗪浓度的升高和持续暴露，镇海林蛙蝌蚪体内的T-AOC受到抑制并逐渐下降，对蝌蚪的抗氧化系统造成了毒害作用[94]。

非酶类抗氧化剂GSH（谷胱甘肽）是多种酶的辅酶，涉及多种生物学过程，参与清除ROS，防护氧化应激对机体产生的损伤[95]。研究发现，蟾蜍的GSH不受甲萘威的胁迫，这可能是由于CAT被抑制，从而维持了GSH水平的结果[96]。NO是一种高活性、膜可渗透的自由基，也是一种重要的信号分子和非酶抗氧化剂[97]。戊唑醇暴露于变态期非洲爪蟾，导致其NO水平下降[98]，ROS会氧化NO合成酶的辅因子，减少其活性，使NO含量降低[100]。

5 农药环境污染物对蛙类代谢器官的影响

代谢是生物体从环境中摄取营养物质转化为自身物质，同时将自身原有组成物转变为废物排出到环境的不断更新的过程。肝脏和肾脏是维持两栖动物正常功能的重要代谢器官。

肝脏有着强大的解毒、代谢、免疫的生理功能，肝脏通过肝药酶清除血液中的废物和外来异物，防止肝损伤以维持生命的正常活动[100]，因此，肝脏是某些农药对非靶标动物毒性的主要靶器官[101]。据报道，检测农田中的两栖动物，仅在其肝脏内就检测出9种农药[102]。农药造成的肝脏毒性主要决定于暴露强度、影响的细胞类型以及化合物的暴露时间。常见的肝损伤类型主要有肝细胞死亡、胆汁淤积、胆管损伤、肝血窦异常、脂肪肝、肝纤维化、肝硬化和肝肿瘤等。戊唑醇和乙胺嘧啶对意大利树蛙蝌蚪肝脏表现出不同的损伤，戊唑醇对肝脏表现出肝变质和肝细胞的间隙扩张[103]；乙胺嘧啶暴露导致意大利树蛙血管扩张及窦充血明显[104]；西玛津可导致非洲爪蟾蝌蚪肝细胞坏死及萎缩[105]；在吡虫啉的作用下，发现炎症细胞聚集在非洲爪蟾幼蛙的肝组织中[35]。三唑酮及其代谢物三唑醇对非洲爪蟾成蛙的肝脏造成肝质膜溶解、肝窦轻度扩张及细胞索结构疏松等损伤[91]；接触敌百虫后的树蛙，发现其肝细胞空泡化、坏死和肿胀[106]；溴氰菊酯增加了沼泽蛙肝脏黑素吞噬聚集物，肝窦扩张、浸润、血管上皮、中央静脉变性等病变[107]；在施用农药的稻田中发现Lysapsus limellum和Rhinella bergi肝窦增大、血运过度、肝细胞空泡化和血管扩张等现象[108]；林蛙接触毒死蜱后，肝纤维化突出[109]，而肝纤维化是慢性肝损伤的病理特征[110]。肝细胞毒性生物标志物是评价肝损伤的重要手段，如丙氨酸转移酶、天冬氨酸转移酶、山梨醇脱氢酶、谷氨酸脱氢酶等。啶虫脒引起了埃及蟾蜍血清中肝功能酶活性异常[111]。

两栖动物在新陈代谢过程中会产生多种废物，大部分废物通过肾小球滤过、肾小管的重吸收及分泌功能排出，同时排出体内的多余水分，以此调节体内的酸碱平衡，并维持内环境的稳定[112]。而污染物在两栖动物体内的堆积会破坏以上平衡，对肾脏产生负面的影响[113]。常见的肾脏损伤有水肿、肾小管扩张、单核细胞浸润、肾小管上皮细胞变性、出血及纤维化等。在敌百虫的胁迫下林蛙蝌蚪外观浮肿严重，解剖后发现其鳃腔内充水，肾脏器官颜色异常呈灰白色[114]；戊唑醇的暴露造成意大利树蛙蝌蚪肾脏炎症，并导致肾小管扩张、出血及单核细胞浸润等损伤[104]；溴氰菊酯造成沼泽蛙肾脏肾小球收缩、肾小管上皮细胞变性、肾小囊细胞肥大等一系列问题[106]；在西维因的暴露下，在蟾蜍的肾脏中观察到肾小管上皮变形、空泡化、核溶解、坏死、出血及纤维化[115]。除此以外，研究还发现农药的存在会抑制肾脏的发育，敌敌畏的暴露，抑制了斑腿泛树蛙肾脏的发育，导致其肾脏萎缩[116]。

6 农药环境污染物对蛙类免疫系统的影响

免疫是阻止机体受到病原体攻击的一种防护措施[117]。两栖动物暴露于农药后，免疫系统是其抵抗外来物质的重要场所[118]。农药对两栖动物免疫系统的直接或者间接损害，将导致免疫细胞发生变化，进而影响机体的免疫反应。注射炎症介质巯基乙酸，白细胞数量显著减少，且其吞噬活性减弱与炎症介质巯基乙酸模型相比，低浓度的莠去津对北方豹蛙也产生了类似的作用，表现为白细胞数量减少，吞噬活性降低，降低了炎症反应的应答[119]；北方豹蛙和非洲爪蟾暴露于6种混合农药后，对寄生虫的抗性减弱，其中豹蛙蝌蚪中淋巴细胞数量显著减少[120]，爪蟾蝌蚪中脾细胞和吞噬细胞数量显著减少[121]。

农药的暴露，对免疫细胞相关酶也造成了一定的影响，它们是维持脊椎动物机体免疫系统功能重要的酶[122]。在倍硫磷和氧乐果的暴露下，青蛙组织中MPO（髓过氧化物酶）活性增加[123]。MPO是中性粒细胞释放的防止病原体侵入机体的一种酶，在生理过程下，病原菌侵入机体MPO形成次氯酸，促进吞噬溶酶体内所含微生物的破坏[124]。随着MPO活性的增加，产生的次氯酸促进了宿主组织损伤。

农药还可改变免疫基因的表达，不仅抑制了免疫反应，还增加了两栖动物感染寄生虫的风险。莠去津抑制了非洲爪蟾蝌蚪中与免疫功能相关的7个基因的表达[125]；氯氰菊酯和噻苯达唑长期暴露引起非洲爪蟾蝌蚪线粒体热激蛋白hsp 70和IL-1b（白细胞介素1b）显著上升[126]。莠去津[127]和西维因[128]导致幼体和变态期的非洲爪蟾抗病毒能力减弱，蝌蚪在感染FV3（蛙病毒3型）病毒后死亡率增加，炎性因子TNF-α和抗病毒基因IFN-I（I型干扰素）发生显著改变。

7 结论和展望

环境中的农药污染了两栖动物的栖息地，损伤了两栖动物的黏膜、皮肤、组织和器官，影响了两栖动物的变态发育和生长发育过程，降低了两栖动物的免疫能力，使两栖动物的行为活动受限，躲避天敌、捕食、繁殖的能力下降。高效、低毒、低残留的化学农药一直是开发绿色农药和环境友好农药的准则，技术、防控手段和方式的不断改进可以减少化学农药使用的途径，制定科学、合理有效的农药使用准则和规范，评估农药对两栖动物的风险，防止农药在环境中的污染及对非靶标生物造成的影响，对在全球两栖动物数量锐减的背景下更好地保护两栖动物具有重要意义。