GATA4和RUNX2在良性脑膜瘤组织中的表达分析及临床意义*

李红旗，戢翰升,王小波

湖北医药学院附属随州医院：1.病理科；2.神经外科；3.转化医学研究中心，湖北随州 441300

脑膜瘤是中枢神经系统最常见的原发性肿瘤之一，占所有原发性脑肿瘤的37%以上[1]。根据世界卫生组织(WHO)的分级标准，脑膜瘤在组织学上分为Ⅰ～Ⅲ级，其中Ⅱ级和Ⅲ级脑膜瘤具有侵袭性，为恶性脑膜瘤，80%的脑膜瘤为Ⅰ级，是良性脑膜瘤。然而，20%的Ⅰ级脑膜瘤在完全切除后会复发，这表明需要做进一步的风险分层来指导良性脑膜瘤患者随访期间的管理[2]。GATA结合蛋白4(GATA4)是一种锌指转录因子，对早期胚胎的心脏和肠道发育非常重要，具有组织特异性，GATA4基因敲除小鼠由于心脏和肠道缺陷在胚胎发育早期死亡。研究显示GATA4表达异常与肺癌、胃癌和鼻咽癌等肿瘤的发生、发展密切相关，既可以充当抑癌因子，又可以充当促癌因子[3-5]。符方旭等[6]报道GATA4在恶性脑膜瘤中阳性表达增加，并与患者预后不良相关。Runt相关转录因子2(RUNX2)也称为核心结合因子1，已被证明是成骨细胞分化所需的主要转录因子，缺乏RUNX2的小鼠由于成骨细胞生成缺陷而无法进行骨化[7]。研究表明RUNX2在乳腺癌、胃癌和胰腺癌等肿瘤中发挥促癌作用，能促进细胞增殖和转移，增强化疗药物抵抗[8-10]。但目前GATA4和RUNX2在良性脑膜瘤中的表达情况和临床价值尚不清楚，因此本研究分析了良性脑膜瘤GATA4和RUNX2的表达情况，对GATA4和RUNX2的表达与患者预后的关系进行了探讨，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 将2013年1月至2017年1月本院收治的100例良性脑膜瘤患者纳入研究，男39例、女性61例；年龄：≤40岁42例、>40岁58例；肿瘤部位：额部41例、蝶骨嵴30例、岩骨斜坡12例、其他17例；肿瘤最大径：≤5 cm 55例、>5 cm 45例；组织类型：上皮型32例、纤维型29例、过渡型15例、其他21例，瘤周水肿：有52例、无48例，Ki-67指数：<4% 69例，≥4% 31例。纳入标准：(1)患者术前未进行化疗或放疗；(2)患者为首次手术切除；(3)手术后经病理切片明确诊断为WHO Ⅰ级良性脑膜瘤；(4)具备完整的临床病理资料和随访资料。排除标准：(1)合并严重的器质性或精神性疾病；(2)合并其他原发性肿瘤；(3)术后并发症死亡者。研究经本院伦理委员会审批通过，纳入研究的患者均对本研究知情同意。

1.2仪器与试剂 Trizol试剂购自美国Invitrogen公司；无水乙醇、异丙醇和氯仿购自天津风船化工试剂有限公司；反转录和实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)试剂购自日本Takara公司；GATA4和RUNX2的引物均由上海生工生物科技有限公司合成；枪头和无RNA酶EP管购自美国Coring公司；PCR扩增仪器购自美国Bio-Rad公司；7500 qPCR仪购自美国ABI公司。

1.3方法

1.3.1GATA4和RUNX2表达水平的检测 采用Trizol法提取手术切除的良性脑膜瘤和瘤旁组织的总RNA，紫外分光光度法检测RNA纯度[吸光度(A)比值A260/A280=1.9～2.1符合要求]和浓度。采用反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA。采用qPCR检测组织中GATA4和RUNX2的表达水平。引物序列如下，GATA4 F：5′-CCCAATCTCGTAG ATATGTTTGAC-3′，R：5′-CCGTTCATCTTGTGGTAGAG-3′;RUNX F：5′-CCGGAATGCCTCTGCTGTTATGA-3′，R：5′-ACTGAGGCGGTCAGAGAACAAACT-3′；内参β-actin F：5′- ACTGGTCTCAGTCAGTGTACAGC-3′，R：5′-ACAGGAA GTCCCTTGCCATC-3′。采用20 μL PCR体系：SYBR Green preMix 10 μL，上下游引物各2 μL，Rox Ⅱ 0.4 μL，cDNA 1 μL，蒸馏水6.6 μL。反应条件：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，共循环40次。采用2-ΔΔCT计算GATA4、RUNX2的相对表达水平。

1.3.2随访资料收集 对纳入研究者进行5年随访，对患者复发情况进行记录。

2 结 果

2.1良性脑膜瘤中GATA4和RUNX2的表达水平 良性脑膜瘤及瘤旁组织中GATA4的相对表达水平分别为1.53±0.46、0.77±0.14，RUNX2的相对表达水平分别为1.76±0.51、0.82±0.16。与瘤旁组织相比，良性脑膜瘤组织中GATA4、RUNX2的表达水平均明显增加(t=9.21、10.73，P<0.05)。

2.2良性脑膜瘤组织中GATA4和RUNX2表达水平的相关性 Pearson相关分析显示：良性脑膜瘤组织中GATA4和RUNX2的表达水平呈正相关(r=0.218，P=0.029)。

2.3GATA4、RUNX2表达水平与良性脑膜瘤患者临床病理参数之间的关系 GATA4、RUNX2在良性脑膜瘤组织中的表达水平与性别、年龄、肿瘤部位、组织类型和肿瘤分期无关(P>0.05)，而与肿瘤最大径、有无瘤周水肿及Ki-67指数有关(P<0.05)，见表1。

表1 GATA4和RUNX2在良性脑膜瘤组织中的表达水平与临床病理参数之间的关系

2.4良性脑膜瘤组织中GATA4、RUNX2表达水平与患者预后的关系 随访资料显示：纳入研究的100例患者中，复发15例，5年复发率为15.00%(15/100)。GATA4高表达组和GATA4低表达组的5年复发率分别为26.67%(12/45)和5.45%(3/55)。GATA4高表达组的5年复发率显著高于GATA4低表达组(χ2=4.645，P=0.0311)；RUNX2高表达组和RUNX2低表达组5年复发率分别为35.13%(13/37)和3.17%(2/63)，RUNX2高表达组的5年复发率显著高于RUNX2低表达组(χ2=18.50，P<0.001)。见图1。

注：A为GATA4表达水平对良性脑膜瘤患者预后的影响；B为RUNX2表达水平对良性脑膜瘤患者预后的影响。

2.5单因素和多因素Cox回归分析良性脑膜瘤患者复发的危险因素 单因素和多因素Cox回归分析显示：GATA4高表达、RUNX2高表达、肿瘤最大径>5 cm、有瘤周水肿和Ki67指数≥4%是良性脑膜瘤患者复发的独立危险因素(P<0.05)，见表2。

表2 Cox回归分析影响良性脑膜瘤患者预后的独立危险因素

3 讨 论

脑膜瘤的处理方式选择包括观察、手术切除和放射治疗。研究显示，即使是良性脑膜瘤也可能复发，其长期随访中的复发率高达47%，对于复发的患者经常需要额外的手术治疗或补救性地进行放射治疗，预后不良[2]。因此，预测良性脑膜瘤复发的能力是良性脑膜瘤临床管理的关键组成部分。有研究表明一些差异性的分子表达与脑膜瘤的复发和进展有关，例如端粒酶反转录酶(TERT)启动子突变、DNA甲基化或组蛋白H3K27me3缺失等[11]，提示研究脑膜瘤进展中发生改变的分子可能对监测良性脑膜瘤复发具有重要价值。

GATA4家族属于锌指转录因子家族，其在细胞增殖和分化中发挥重要作用。其中GATA4以高度动态的方式与共有序列结合，可以在器官发生过程中调节多种靶基因的表达，被认为是调控细胞命运的关键控制器。GATA4(V238G)的错义突变导致小鼠肺结构异常和死胎，但是在人类肺癌标本中发现了GATA4启动子的高频甲基化，GATA4经表观遗传修饰后沉默，有抑癌作用[12]。ZHOU等[5]报道GATA4在鼻咽癌组织和细胞系中表达上调，并与肿瘤大小、转移和预后不良有关，促进鼻咽癌细胞的增殖和转移能力，表明GATA4在肿瘤的恶性进展中具有功能多样性，在不同的肿瘤中可能发挥相反的作用。研究报道，GATA4在脑膜瘤组织中的阳性表达率增加，并且在WHO分级较高及颅外转移的脑膜瘤组织中阳性表达率更高，并且是恶性脑膜瘤患者预后不良的危险因子[6]。大多数脑膜瘤是良性的，GATA4对良性脑膜瘤的预后判断是否具有指导价值还不清楚。本文研究结果显示，脑膜瘤组织中GATA4的表达水平显著高于瘤旁组织(P<0.05)。同时，在肿瘤最大径>0.5 cm、有瘤周水肿及Ki-67指数≥4%的良性脑膜瘤患者中GATA4的表达水平较高(P<0.05)。ZHOU等[5]报道GATA4在鼻咽癌中表达上调，并通过调节Slug信号通路促进上皮-间质转化和转移能力。SU等[13]报道在胰腺癌中WDR3与GATA4相互作用激活Hippo信号通路促进肿瘤的进展。Slug及Hippo信号通路在正常发育过程中发挥重要作用，同时在肿瘤中也处于激活状态，均促进肿瘤的恶性进展，因此笔者推测在良性脑膜瘤中GATA4可能通过调控Slug或Hippo等信号通路促进肿瘤的复发，但是本课题组尚未对此进行研究，仍需后续在细胞水平进行实验验证及探讨。本研究进一步分析发现GATA4高表达的良性脑膜瘤患者复发率较高，是患者复发的独立危险因素，表明GATA4可作为良性脑膜瘤预后判断的参考指标。

有研究显示，GATA4和RUNX2共定位，并且GATA4通过在RUNX2启动子和增强子处维持染色质开放，上调RUNX2表达水平，从而调控成人骨的形成[14]。RUNX2在乳腺癌和胃癌等多种肿瘤的疾病进展中发挥关键作用，促进肿瘤细胞的增殖和转移。RUNX2在胃癌早期高表达，并与患者临床病理特征相关，RUNX2是影响胃癌患者预后的独立危险因素[9]。然而，RUNX2在良性脑膜瘤中的作用尚未阐明。本文研究结果显示：脑膜瘤组织中RUNX2的表达水平显著高于瘤旁组织(P<0.05)，提示RUNX2参与了脑膜瘤的发生、发展，可能与RUNX2的磷酸化水平增高相关，有研究报道RUNX2磷酸化后其活性增加促进乳腺癌细胞的侵袭[8]。本研究结果中，RUNX2在肿瘤最大径>0.5 cm、有瘤周水肿及Ki-67指数≥4%的良性脑膜瘤患者中的表达水平较高(P<0.05)，与RUNX2在胃癌中的研究具有一致性，在胃癌中RUNX2通过调节yes1相关转录调节因子(YAP1)发挥促癌作用[9]。YAP1作为Hippo信号通路的关键基因，在脑膜瘤的相关研究中被报道为促癌基因[15]，而GATA4也调控Hippo信号通路[13]，因此GATA4可能通过结合并调控RUNX2的表达，激活Hippo信号通路促进良性脑膜瘤的进展。同时，本研究结果显示良性脑膜瘤组织中GATA4和RUNX2的表达呈正相关，也能辅助证实该结论，但是具体的作用机制还需后续进一步研究。本研究结果发现，RUNX2高表达的良性脑膜瘤患者复发率较高，并且RUNX2高表达是良性脑膜瘤患者复发的独立危险因素，表明检测RUNX2的表达水平有助于良性脑膜瘤患者的随访管理。此外，本研究还显示肿瘤最大径>0.5 cm、有瘤周水肿及Ki-67指数≥4%均是良性脑膜瘤患者复发的独立危险因素，与BICZOK等[16]的研究具有一致性。

综上所述，GATA4和RUNX2均在良性脑膜瘤中表达上调，并在肿瘤最大径>0.5 cm、有瘤周水肿及Ki-67指数≥4%的患者中表达水平更高，两者都是良性脑膜瘤复发的独立危险因素。