疫苗有效性评价及面临的科学问题

刘一凡

中国医学科学院医学生物学研究所

李国良

中国医学科学院医学生物学研究所

王佑春*

中国医学科学院医学生物学研究所

确保生物制品的质量、安全性和有效性是生产企业的首要责任，而国家监管机构同样需要建立相关程序确保生物制品符合质量要求、有足够的安全性和有效性[1]。作为特殊的生物制品，疫苗接种人体后可刺激免疫系统产生特异性体液免疫和细胞免疫应答，使人体获得对相应病原微生物的免疫力[2]，对防护个人免除相应病原微生物的感染以及预防和控制传染病传播和流行至关重要。安全性和有效性是疫苗评价过程中两个非常重要的指标，尤其是疫苗的有效性。根据美国《联邦法规汇编》（Code of Federal Regulations,CFR），有效性是指产品能够产生其预期目的作用的特定能力或效能。它是通过使用该品种预期的给药方法，采用合适的实验室测定方法或者临床对照研究数据获得的[3]。

有效的疫苗接种人体后，可以诱导机体产生具有保护作用的免疫反应，达到预防机体感染相应病原体或减轻疾病症状的效果。疫苗抗原具有与有效抗体结合或与有效淋巴细胞上的抗原受体密切结合的独特结构，抗原物质的这种特性为抗原性，即疫苗有效性评价中的有效抗原。有效抗原往往通过体外免疫学方法进行检测，即通常所说的体外效价（in vitropotency）。作为免疫应答的启动剂，疫苗抗原可以刺激动物和人体免疫系统产生反应，这种诱导免疫反应的能力就是免疫原性。免疫原性往往通过免疫动物检测其诱导免疫反应的水平，通常称为体内效价（in vivopotency）。作为反映有效性的关键质量属性，体外效价和体内效价是疫苗检测的主要指标。但无论是体外效价还是体内效价，都是检测疫苗有效性的间接指标；只有检测其预防动物或人体感染相应病原体的能力或减轻相应症状时，才是评价疫苗有效性的直接指标。因此，在开展疫苗临床试验前，往往需要选择合适的动物模型进行动物感染病原体的保护试验。动物模型显示明显的保护作用后方可开展临床试验，通过临床试验来充分验证疫苗的有效性。本文将从疫苗抗原性、免疫原性、动物体内保护效果和人体保护效果评价4 个维度来进行讨论。

1 疫苗抗原性检测

疫苗抗原性即体外效价的检测，是疫苗评价的重要一环。目前，疫苗抗原性检测主要存在以下3 个瓶颈。首先，不同企业同一类疫苗的抗原性检测结果缺乏可比性。现今，对疫苗的抗原性检测主要以中和抗体为基础制备相应的免疫方法进行检测，但不同企业选择不同中和表位的抗体，无法对检测结果进行可比性研究。即使选择相同表位的抗体进行检测，但由于不同企业的生产工艺存在差异，检测结果同样缺乏可比性。其次，随着多联、多价疫苗的问世，如多价人乳头瘤病毒疫苗、多价肺炎疫苗、A 群C 群脑膜炎球菌b 型流感嗜血杆菌联合疫苗、无细胞百白破b 型流感嗜血杆菌联合疫苗、无细胞百白破脊髓灰质炎b 型流感嗜血杆菌联合疫苗、百白破b 型流感嗜血杆菌和脊髓灰质炎、乙型肝炎六联疫苗等，多价、多种抗原的联合增加了疫苗抗原性检测的复杂性。再次，在过去几十年中，疫苗佐剂尤其是新型复杂佐剂得到了巨大发展。佐剂同疫苗抗原间存在相互作用，一定程度上增加了疫苗抗原性检测的难度。

突破上述瓶颈，需要对检测用的中和抗体进行大量筛选，以此获得针对主要且不易被破坏表位的抗体。这类抗体往往结合特殊或复杂的抗原表位，通过用这类抗体建立抗原的免疫检测方法，可有效解决上述瓶颈问题。下文将结合人乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV）疫苗和狂犬病疫苗有效抗原的检测进行具体说明。

1.1 HPV16 疫苗有效抗原检测

宫颈癌是影响全球女性健康的第四大恶性肿瘤。HPV16 作为宫颈癌最普遍的型别[4]，是引发宫颈癌的主要原因。由于HPV疫苗生产企业采用了不同的表达系统和生产工艺，在检测过程中需要一种能够识别优势中和表位并能与各种病毒样颗粒产生反应的单克隆抗体。通过大量筛选研究，筛选出5 种针对HPV16 的单克隆抗体（V5、8A9、5C10、4G12 和001），并以此建立HPV16 抗原的检测方法，对5 种不同抗原分别进行检测。结果显示，单克隆抗体001 的检测值与蛋白定量最为接近，且离散程度最小。而且，不同疫苗产生的中和抗体滴度与单克隆抗体001 的量值相关性最好。中国食品药品检定研究院（以下简称中检院）团队进一步针对不同表达系统来源的病毒样颗粒抗原开展了方法适用性检测，所有检测值与蛋白定量相近，且各组之间的差异不具有统计学意义。在进一步研究过程中，通过冷冻电子显微镜等技术对抗体结构进行解析，发现单克隆抗体001 结合于HPV L1蛋白的DE、FG 和HI 环区，位于五聚体的间隙[5]。单克隆抗体001 独特的结合特点可以使多个抗体同时结合时不存在空间位阻，减少了检测差异，使不同表达系统来源的抗原检测结果更有可比性。综上，单克隆抗体001可适用于不同表达系统来源的HPV16 疫苗有效抗原的检测，且结果具有很好的可比性。

1.2 狂犬病疫苗有效抗原检测

狂犬病病毒抗原含量是关系到狂犬病疫苗有效性的重要因素。糖蛋白是狂犬病病毒唯一能诱导宿主产生中和抗体并与之结合的蛋白。世界卫生组织（WHO）推荐体外方法，即通过对糖蛋白定量进行狂犬病疫苗的效力测定[6-7]。相比需要使用大量小鼠、检测时间长、对操作人员技术要求高、检测方法变异性大的NIH 体内方法，体外方法可以有效减少检测时长和实验动物的使用量，具有易操作、方法稳定等优点。国内外学者通过选择不同的、具有中和活性的单克隆抗体，建立了多个检测方法（表1）[8-14]，而且与NIH 体内方法具有较好的相关性。但由于所使用的狂犬病病毒株、生产工艺、疫苗类型（人用疫苗或兽用疫苗、是否含有佐剂等）、所使用单克隆抗体识别抗原位点存在差异等因素，目前尚未有统一的检测方法可用于所有毒种生产的狂犬病疫苗抗原性检测。

表1 已报道的狂犬病疫苗抗原性检测方法

中检院团队制备了大量的中和抗体，通过对狂犬病病毒的疫苗株和90 多个街毒的假病毒进行检测，筛选出4 个广谱性好的单抗（06-2A12、07-4D8-1C1、05-2F10、14-4E8-1E3）。这4 个单抗不仅能够中和各疫苗株，而且中和滴度高。通过方法的系列筛选和优化，选取 07-4D8-1C1 和06-2A12 作为包被单抗，05-2F10-HRP 作为标记单抗，可以高效检出7 个厂家的疫苗株，且对7 个厂家疫苗的检测灵敏度高，适用于所有疫苗株制备的疫苗。该方法对其他人用疫苗和辅料成分无交叉反应，具有良好的专属性。

2 疫苗免疫原性检测

免疫原性也是疫苗有效性评价的重要指标之一[15]。对疫苗免疫原性的检测通常是选择合适的动物模型，待完成疫苗免疫后，检测动物有效的免疫反应。通常在检测中和抗体的基础上，可通过计算诱导免疫反应的半数有效量（ED50）、抗体滴度和抗体阳转等指标进行判定。传统的中和抗体检测方法如空斑减少中和试验（plague reduction neutralization test，PRNT）和细胞病变法（cytopathic effect，CPE）等都是建立在活病毒的基础上。活病毒较难获得，对于实验室的生物安全等级要求较高，检测周期长，对于操作人员的要求也较为严格，且实验结果的判读存在主观性。因此，为应对快速检测的需求，研究人员建立了使用假病毒的中和抗体检测方法，可以有效突破传统方法的局限性。

假病毒技术可以模拟病毒的膜结构，可以代替活病毒用于研究和检测[16]。使用假病毒对中和抗体进行检测的原理在于：假病毒与活病毒有相同膜蛋白，可以有效模拟病毒感染细胞的过程；假病毒含有报告基因，可以有效检测、示踪中和抗体。与传统检测方法相比，使用假病毒进行中和抗体检测具有以下优点：①容易获取：可在实验室内合成基因、构建病毒，避免了长途转运病毒过程中存在的风险。②无需培养：可以通过质粒转染，制备病毒。③安全性高：单轮感染可以在生物安全二级（BSL-2）条件下进行。④周期短：通常可在24～72小时内完成，可实现自动化。⑤定量客观：因其含有报告基因，可以对中和抗体进行客观定量[17]。

在建立使用假病毒对中和抗体进行检测的过程中，中检院团队对细胞敏感性、细胞量、病毒加入量、检测时间等参数进行了标准化研究；对分析检测方法的专属性、准确性、耐用性和重复性等技术指标进行了验证。而且，为进一步确认方法的适用性，与传统检测方法进行了对比验证，结果显示基于假病毒的中和抗体检测方法稳定、可行，与传统的细胞培养方法具有很好的相关性[18]。

在此基础上，中检院团队建立了多型别病毒抗体自动化检测系统，可实现同时对多种病毒进行检测。通过机械臂，可进行扫码、开盖、样品稀释、自动培养和检测，可有效降低检测成本、提高通量，进一步提升检测效率[19]。

体内效价检测通常需要大量的实验动物，检测时间长，且检测方法的耐用性和重复性差[20]。相比体内检测，体外检测方法具有简便性。近年来，监管机构和疫苗生产企业在疫苗有效性评价指标设置中均倾向于使用体外检测方法。WHO 发布的非临床[21]、批放行[22]等技术指导原则中均明确鼓励使用3R 原则（替换、减少、优化）；欧盟在2010年以立法的形式将3R 原则纳入欧盟指令2010/63/EU[23]；美国和欧盟药品监管机构接受对采用病毒样颗粒制备的乙肝疫苗和HPV 疫苗开展体外效力试验[20]；在新冠疫情期间，美国和欧盟对进行体外效力试验的新冠mRNA 疫苗和病毒载体疫苗进行了批产品放行[20]。我国同样鼓励使用体外方法，《中国药典》（2020年版）规定：“应尽可能采用准确的理化分析方法或体外生物学方法取代动物试验进行生物制品质量检定，以减少动物的使用。”但使用体外检测方法需要进行充分验证。

3 动物体内保护效果的评价

动物保护性试验是疫苗研发中的必经阶段，只有在动物保护性试验中证明有效，才能进入后续临床试验。在动物体内开展保护效果评价的关键在于是否有对病原易感的动物模型，在进行疫苗接种后是否能产生和人体相同或相近的免疫应答。在构建易感动物模型时，通常需要采用基因编辑技术对特定的基因进行改造，耗时长、难度大。除此之外，另一瓶颈在于缺乏动物体内保护效果与免疫反应相关性的数据。本文将从以下3 个方面对开展动物体内保护效果评价的动物模型构建策略进行探讨。

3.1 对有明确病毒受体的基因修饰动物的研发

有些病毒通过特定受体对人体进行感染，然而诸如广泛用于动物研究的小鼠与人的受体存在差异，导致小鼠对于部分病毒并不易感。对于有明确病毒受体，人-鼠受体分子存在差异的病毒，通过基因修饰技术，将人的受体定点插入小鼠体内或进行置换，使得小鼠可以表达人的受体分子，从而变得对病原易感。目前，中检院团队已成功构建了表达肠道病毒71 型（EV71）[24]、中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）[25]、新型冠状病毒（SARS-CoV-2）[26]、脊 髓灰质炎病毒、麻疹病毒等受体分子的小鼠模型。

本文将以EV71 为例进行详细说明。在EV71 疫苗的研究开发过程中，虽然相关单位建立了EV71 感染的非人灵长类动物模型和乳鼠模型，但使用非人灵长类动物模型成本高、有伦理学限制，乳鼠模型对年龄要求较高，稳定性差[24,27]。鉴于hSCARB2是人类体内体外感染EV71 的关键受体[28]，中检院团队利用胚胎干细胞靶向技术，构建了表达hSCARB2 受体纯C57BL/6 基因背景的敲入小鼠模型（以下简称hSCARB2 小鼠）。在完成模型构建后，对hSCARB2 小鼠模型进行了感染验证。通过Q-PCR检测小鼠感染后EV71 的分布，在后肢、口、脑、心脏、肺、肌肉等组织或器官中均检测到病毒分布。借助增强绿色荧光蛋白和生物膜干涉技术，呈现了可视化的小鼠“手足口”模型，并发现拷贝数与荧光值具有明显相关性，可作为判定是否感染的有效证据。感染后小鼠体重下降，感染后脑、后肢发生病理改变，并通过免疫组化检测到病毒[24]。

随后，采用 hSCARB2 小鼠对EV71 中和抗体的体内保护效果进行了检测，建立了中和抗体和保护效力间的量效关系。接着，用完成Ⅲ期临床试验的EV71 疫苗对该系统评价疫苗保护效果的能力进行了验证，结果证明：hSCARB2 小鼠模型能够很好地评价EV71 疫苗的有效性，并初步建立有效性与抗体水平之间的关系[24]。

在以上研究的基础上，采用颅内及尾静脉攻毒两种方式，均观察到EV71 疫苗能抵御致死性病毒攻击，并且能观察到接种疫苗后，小鼠脑、肌肉及肺中病毒载量显著下降，建立了EV71 疫苗体内效力的直接评价方法[28]。

综上，hSCARB2 小鼠模型对于EV71 病毒株具有良好的易感性，可有效模拟人体感染EV71 后产生的临床特征。运用hSCARB2 小鼠模型进行疫苗保护效果评价，简单便捷、重复性强，能有效评估EV71 疫苗的保护效果，可作为有效的疫苗质量评价手段。

3.2 免疫缺陷类基因修饰动物的研发

有些病毒的受体不明确，无法对小鼠等动物进行基因修饰。但通过部分免疫缺陷可以使病毒敏感，如敲除特定基因，使T/B/NK 细胞缺陷，或敲除干扰素（interferon，IFN）或其他信号通路的基因。中检院团队构建了Rag1、Rag2、IFNRα/β、IFNRγ、IFNRαβ/γ、STAT1、STAT2、Sting 敲除的大、小鼠模型，可用于针对肺炎病毒、寨卡病毒、人类嗜T 淋巴细胞病毒-1（HTLV-1）和基孔肯亚病毒等病毒的研究。值得一提的是，敲除干扰素信号通路小鼠模型可支持30 多种病毒的感染，几乎为开展疫苗、抗体评价研究工作中的万能模型。但这类小鼠毕竟存在免疫缺陷，能否客观、准确地评价疫苗的有效性还有待进一步的评估。

3.3 假病毒感染动物模型的建立

利用假病毒的技术优势，选择使用高滴度的假病毒、采用不同的接种方式（如腹腔注射、胸腔注射、静脉注射等），先后构建了针对埃博拉病毒、马尔堡病毒、H7N9 禽流感病毒等系列病毒的小鼠模型。在用该体系对疫苗有效性进行评价时，如果产生保护效果，假病毒会被中和抗体所中和，从而阻止假病毒感染小鼠组织。假病毒采用发光标记，使用活体成像系统可直观显示病毒感染的强弱变化，从而能对疫苗效力进行直观、可定量的评价[16]。通过建立假病毒感染动物模型，不仅可以避免活病毒的使用，降低生物安全风险，还可以更加直观地检测，对疫苗候选抗原的筛选提供了很大的便捷性。

4 人体保护效果的评价

虽然可以通过动物体内的保护效果来评价疫苗的有效性，但不可否认的是动物模型有时无法预测疫苗在人体内的免疫原性和有效性[21]。因此，在真实世界中进行临床试验，对于评价疫苗的有效性显得尤为重要。不同疫苗的临床试验评价标准不一，通常有预防感染、减少发病和降低重症等，但无论哪一种评价标准，其最终结果都在于证明疫苗的保护效果，并进一步寻找保护效果与免疫指标间的相互关系。

通常来说，疫苗在上市前需要经过Ⅰ期、Ⅱ期和Ⅲ期临床试验。有效性则是在大规模目标人群的III 期临床试验中进行评价。本文将从疫苗保护效力和免疫学替代终点2 个方面进行讨论。

4.1 疫苗保护效力

疫苗保护效力（vaccine efficacy，VE）是指与安慰剂组相比，疫苗接种组疾病或感染减少的比例[29]。具体的计算公式为：疫苗保护效力=（一定观察期内安慰剂组感染率-疫苗组感染率）/安慰剂组感染率。通常在对照临床试验中对疫苗保护效力进行衡量，即通过比较疫苗组与安慰剂组的数据，看有多少人出现了“关注的结局（通常为感染或发病）”。如果一种疫苗效力很高，那么疫苗组中患病的人数会比安慰剂组少得多。此外，疫苗保护效力还可以通过相对风险（relative risk，RR）进行计算[30]。

通过临床试验对疫苗的有效性进行评价是最理想的状况，比如创新型疫苗、缺乏免疫原性替代终点或免疫原性替代终点不明确的疫苗。但开展临床试验需要对流行病学情况和疾病的发生率进行充分考量。如果发病率太低，样本量不足，不利于病例收集，临床试验将难以开展。例如，宫颈癌发病需要10 多年的时间，短期内基本不可能发生感染后致癌的情况。若从接种HPV 疫苗开始一直观察到宫颈癌发生，这样的临床设计难以满足疫苗研发的需求。还有一些疫苗，对应疾病的发病率低，很难在有限的时间里收集有效病例，从而限制了对疫苗有效性评估的进程。

4.2 免疫学替代终点

免疫学替代终点（surrogate of protection，SOP）的概念由WHO 提出，其定义为：由疫苗诱导产生的，与接种疫苗后临床终点事件（感染或发病）的发生相关，可用于预测疫苗保护效果的免疫学反应指标（体液免疫或细胞免疫）。在以免疫学指标为终点的临床试验中，可以直接应用已建立的免疫学替代终点，分析比较试验疫苗组和对照疫苗组的保护率，即计算免疫学反应水平大于或等于免疫学替代终点水平受试者的百分比，以评价2 种疫苗保护效力的差异[31]。

经过多年研究，对于部分疫苗有了深入的了解，明确了保护性免疫指标与临床终点的关系、免疫原性和临床保护效力的相关性。这类疫苗含有相同抗原成分，往往不止一个生产厂家，在真实世界中得到了广泛运用，因此可以采用选择免疫学替代终点，采用可靠的实验室检测方法对疫苗的有效性进行评价[31]。

在临床研究过程中，达到免疫学替代终点的疫苗可产生最低保护水平，在一定程度上能证明疫苗的有效性。使用免疫学替代终点的临床试验可以有效减少试验所需的样本量，缩短随访时间，降低临床试验的费用，在一定程度上可以有效地推动疫苗的研发进程。但对于已建立免疫学替代终点的疫苗，仍需要在真实世界中进行持续观察，必要时甚至需要做出修正，确保其持续有效。

5 结语

有效性是疫苗很重要的技术指标，贯穿疫苗的全生命周期。无论是早期研发过程中对于抗原含量或体外效价的测定，在动物体内开展的体内效价测定、保护效果评价，临床试验，还是上市后的使用，都需要对疫苗有效性给予高度关注。目前，疫苗有效性检测和评价仍然存在一些瓶颈，在具体开展研究工作的时候需要根据不同疫苗的特性，具体问题具体分析，在开展充分研究的基础上确定出具体的检测方法，并对检测方法进行充分验证，保障检测方法客观、准确。