耐碳青霉烯类高毒力肺炎克雷伯菌的研究进展*

孔娜娜,严育忠,杨德平 综述,刘维薇△ 审校

1.上海中医药大学附属龙华医院检验科,上海 200032;2.上海健康医学院附属周浦医院检验科,上海 201318

肺炎克雷伯菌(KP)是一种机会致病菌,可在尿道、呼吸道、血液和软组织中引起传染病。根据KP的表型和基因型特征,可将KP分为经典KP(cKP)和高毒力KP(hvKP)。hvKP的毒力高于cKP,具有独特的表型特征(如高黏液型、特殊血清型)和基因型特征(如携带特殊的毒力基因),其临床致病力更强,不仅能感染免疫功能低下的人群,还能使免疫功能正常的年轻人群发生重症社区获得性感染,如化脓性肝脓肿、眼内炎和脑膜炎甚至骨髓炎等。碳青霉烯类抗菌药物作为一种广谱抗菌药物,是临床治疗多重耐药革兰阴性细菌感染的最后一道防线。近年来,这类抗菌药物在临床的广泛应用导致耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌(CRKP)的检出率逐年升高,CRKP已成为危害患者生命健康的重要病原体。hvKP和CRKP可通过获得携带碳青霉烯耐药基因或毒性编码基因的质粒而进化为耐碳青霉烯类高毒力肺炎克雷伯菌(CR-hvKP),此外,cKP也可通过获得携带碳青霉烯耐药基因和高毒力基因的杂交质粒进化为CR-hvKP[1]。CR-hvKP 兼具多重耐药和高毒力特性,其引起的感染常累及多个部位或发生侵袭性转移,且目前缺乏有效的治疗药物[2]。CR-hvKP已经在全球范围内传播,对人类公共卫生构成了巨大威胁。本文对近年来CR-hvKP的研究进展进行了简要综述。

1 CR-hvKP的流行情况

自20世纪80年代中期以来,被称为hvKP的特殊KP谱系在世界范围内出现,可导致患者多部位发生转移性传播的化脓性感染(如肝脓肿、骨髓炎和眼内炎),甚至在免疫力强的宿主中也是如此,因此hvKP引起的感染逐渐成为全球关注的重点。近年来,由于碳青霉烯类抗菌药物在临床中的广泛应用及不合理使用,碳青霉烯耐药基因和耐药质粒在菌株间水平传播,全球各地陆续出现CR-hvKP感染的相关报道。2018年GU等[3]首次从肝脓肿继发血流感染患者中分离出ST11型CR-hvKP。同年AMIR等[4]报道了一家医院ICU内实施机械通气的5例患者暴发CR-hvKP的院内感染,并导致4例患者死亡。2019年,KARLSSON等[5]从门诊患者中分离出1株ST23型CR-hvKP,该菌株携带高毒力基因和碳青霉烯酶编码质粒。2020年CHEN 等[6]对5年间住院患者的556株CRKP进行回顾性研究,分离到18株均携带pKPC-2耐药质粒的CR-hvKP。2021年埃及一家医院分离出1株同时携带blaKPC-2和blaNDM-1基因的CR-hvKP[7]。

不同国家CR-hvKP的 ST分型表现出一定的地域差异,美国、印度、俄罗斯、埃及、意大利等国家的CR-hvKP以ST11、ST23和ST258型为代表。亚洲是CR-hvKP感染的主要流行地区,以中国、印度和新加坡为代表,其中,中国报道的CR-hvKP感染的病例数量最多,最常见的序列类型为ST11,其次是ST23、ST25和ST65。欧洲主要的碳青霉烯耐药基因是blaNDM、blaOXA基因,而blaKPC-2基因在美国更为普遍。在中国,CR-hvKP中广泛存在blaKPC-2基因,在其他亚洲国家如印度、伊朗,blaOXA和blaNDM基因更为常见。日本的一项研究发现,亚胺培南水解酶(IMP)的检出率为100%[8]。2020年,苏丹报道了10株同时携带blaNDM和blaOXA-48基因的CR-hvKP[9]。此外,在过去两年里埃及报道了2例ST11型CR-hvKP感染病例,其中1株同时携带blaKPC-2和blaNDM-1基因[7],而另1株同时携带blaKPC-2和blaOXA-48基因[10]。

2 CR-hvKP毒力影响因素

尽管世界各国对hvKP的定义未不统一,但一些遗传特征被认为是毒力菌株的标志。这些遗传特征主要包括2种:(1)黏液样表型调节因子的辅助毒力因子,包括rmpA、rmpA2基因及高黏性和高毒力所必需的rmpD基因; (2)铁载体(SPs)系统,包括有氧肌动蛋白(iucABCD)、尿囊素、大肠杆菌肌动蛋白、耶尔森菌素和沙门菌素生物合成位点[11]。其他毒力因子可能参与编码铁代谢和转运,血红素和赖氨酸转运系统,代谢转运蛋白和毒力基因表达、转录、调控蛋白质的过程[12]。

2.1荚膜多糖 在血琼脂平板上,CR-hvKP 通常呈高黏液性,高黏液表型通常由“拉丝试验”确定,即当某个菌落通过接种环拉伸长度>5 mm 时,拉丝试验结果为阳性。CR-hvKP的高黏液表型通常与毒力相关。荚膜多糖是构成CR-hvKP荚膜的重要组成成分,与CR-hvKP的高黏液性密切相关,可以保护细菌免受有害环境因素的影响,并提高细菌的毒力。荚膜多糖的合成受多种基因调控,其中质粒p-LVPK上的2个质粒携带基因(p-rmpA和p-rmpA2)和染色体携带的c-rmpA基因是荚膜多糖合成的重要调节因子[13]。rmpA基因的过表达能增加KP在小鼠感染模型中的毒力,这表明高毒力表型与rmpA基因的过表达相关[14]。但也有研究表明,高黏液表型与毒力之间并无相关性。一项在中国9个地区收集28株CRKP的回顾性研究发现,其中2株不携带rmpA基因的CRKP的拉丝试验结果仍呈阳性。此外,5株CRKP携带rmpA基因,但在拉丝试验中结果呈阴性[15]。因此,拉丝试验不是识别hvKP的一种灵敏、特异的方法。

根据荚膜多糖的结构和抗原性,可将KP分为多种血清型,已知的荚膜血清型有82种。目前的研究显示CR-hvKP以毒力最强的K1 和 K2 血清型最为多见,其次是K47、K64。CR-hvKP的血清型与ST分型之间表现出一定的相关性,K1血清型以ST23型为主,K2血清型以ST65型和ST86型为主, YANG等[16]研究报道K47、K64血清型均以ST11型为主。因此,荚膜多糖可能与细菌毒力有关或可增强毒力,但并不是唯一的细菌毒性决定因素。

2.2铁载体(SPs) SPs系统对于CR-hvKP的生长繁殖至关重要,同时也是CR-hvKP重要的毒力因子。CR-hvKP侵入宿主时可释放SPs。SPs可从宿主体内的结合蛋白中获得铁离子,然后与SPs特异性受体结合,重新进入细胞。最终,CR-hvKP摄铁生长[17]。有研究发现,较高的摄铁能力可介导细菌毒力增强,相关的SPs有耶尔森菌素、沙门菌素、肠杆菌素和气杆菌素[18], 其中气杆菌素是hvKP毒力的主要决定因素,涉及的毒力基因包括irp、iro、ent、iuc、aerobactin等基因。此外,细菌菌毛介导与宿主细胞接触或黏附于黏膜表面是CR-hvKP感染机体的重要介质,涉及的毒力基因包括fim、mrk等基因。

3 CR-hvKP的碳青霉烯类耐药机制

造成KP对碳青霉烯类抗菌药物耐药的主要原因是产碳青霉烯酶,碳青霉烯酶是一种可以水解头孢菌素类、青霉素类及碳青霉烯类抗菌药物的广谱β-内酰胺酶,是治疗革兰阴性菌感染的最后一道防线。近年来这类抗菌药物在临床的广泛应用加速了耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌的出现,KP已成为最常见的耐碳青霉烯类肠杆菌。2016年RAFIQ 等[19]研究报道因膜孔蛋白(Omp)K36突变,在缺乏碳青霉烯类耐药基因的情况下,hvKP表现出对碳青霉烯类抗菌药物耐药的现象。2018年浙江大学附属第二医院的5例术后患者在住院期间感染了携带KPC-2基因的K1-ST11型hvKP,患者最终因对多种抗菌药物耐药而死亡,该细菌被命名为ST11型 CR-hvKP[3], 通过对该细菌进行研究发现其高毒力是由约170 kbp大小的pLVPK-like毒力质粒进化而来,当敲除该质粒后其毒力大幅下降。通过对目前文献进行总结分析,提示CR-hvKP对碳青霉烯类抗菌药物的耐药机制可能存在以下4种途径:(1)hvKP获得碳青霉烯酶编码质粒;(2)CRKP获得hvKP携带的高毒力质粒,如pLVPK-like毒力质粒;(3)hvKP在碳青霉烯类抗菌药物压力诱导下Omp缺失,产生耐药表型;(4)KP获得具有毒力和碳青霉烯耐药基因的融合质粒[1]。

3.1hvKP 获得碳青霉烯酶编码质粒 碳青霉烯类耐药基因编码的碳青霉烯酶在Ambler 分子分类法中属于A、B、D类酶。A类碳青霉烯酶可以水解几乎所有的β-内酰胺类抗菌药物,常见的A类碳青霉烯酶包括KPC、SME、NMC-A、IMI、GES、SFC-l酶等。产KPC酶是KP对碳青霉烯类抗菌药物最常见的耐药机制,KPC酶有许多子类型,包括KPC-2到KPC-13。B类碳青霉烯酶又称金属-β -内酰胺酶,可水解带有β-内酰胺环的各种抗菌药物,常见的B类碳青霉烯酶主要包括NDM-1、VIM-1和IMP。D类碳青霉烯酶主要包括OXA-48和OXA-181。

CRKP携带可移动碳青霉烯耐药基因的质粒、转座子和噬菌体,这些可移动基因原件可以水平转移到hvKP上,形成CR-hvKP。在中国和美国,KPC酶基因是最常见的碳青霉烯酶基因, KPC酶基因阳性的CR-hvKP在这些地区的报道也更多。一份报道显示,在美国最常见的blaKPC酶基因亚型是blaKPC-2和blaKPC-3基因,在亚洲(特别是中国)和欧洲,最常见的类型是blaKPC-2基因[20]。2014年美国首次报道了一种具有高黏液表型的ST23型 KP,该菌株携带blaKPC-2基因,并进化为耐多药CR-hvKP,2015年中国报道了5株K1型 hvKP通过获得携带blaKPC-2基因的毒力质粒或结合blaKPC-2基因的可移动DNA片段形成K1 型CR-hvKP[21]。值得注意的是,B、D类碳青霉烯酶基因的传递主要依赖于质粒,故它们的分布更具区域性。B、D类碳青霉烯酶主要分布在印度、伊朗等亚洲国家和俄罗斯、意大利等欧洲国家。CR-hvKP分离株大多数是OXA-48阳性菌株,其次是NDM-1和VIM-1阳性菌株。在2018年,俄罗斯研究人员首次报道了ST23型hvKP同时携带β-内酰胺酶CTX-M-15基因和碳青霉烯酶OXA-48基因的质粒,并进化为CR-hvKP[22]。同年,伊朗的一项调查报道了5株携带blaVIM-2基因的罕见K1-ST23型CR-hvKP,其中4例患者在住院期间死亡,表明此类CR-hvKP具有高毒力[4]。此外,一项中国的研究报道了一种罕见的IMP阳性菌株CR-hvKPXH210,该菌株具有ST17 KL38/O2血清型,携带耐药质粒pXH210-IMP和blaIMP-4基因[22],实验结果表明pXH210-IMP能从XH210转移到大肠杆菌和KP受体上,说明耐药质粒具有可转移性。此外,XH210在小鼠感染模型中表现出高毒力,但缺乏与高毒力相关的特征标记。上述研究表明,没有明显高毒力表型的hvKP可以通过获得blaIMP-4基因进化为CR-hvKP。移动基因的水平传递是导致KP不断进化为CR-hvKP的关键因素。这些毒性菌株携带碳青霉烯耐药基因表明这些主要的医院病原体正在进化。

尽管碳青霉烯酶的分布因地理特征而异,但全球移民等因素的增加可能导致这些细菌耐药机制与地区或城市之间的联系发生变化。因此,在检测CR-hvKP的相关耐药基因时,不能忽视低流行区。CR-hvKP同时产生2种或2种以上的碳青霉烯酶可引起严重的传染性疾病,导致患者病死率升高。许多国家和地区报道了这些类型的CR-hvKP,例如意大利和伊朗报道了产生NDM-1和OXA-48的CR-hvKP[23-24]。2022年埃及报道了同时携带blaKPC-2和blaOXA-48基因的CR-hvKP[10],该菌株分离株包含2个抗性质粒:pEBSI041-2 (blaOXA-48基因载体)和pEBSI041-3(blaKPC-2基因载体)。pEBSI041-3可以在质粒pEBSI041-2的辅助下转移,在共转移过程中,2个质粒可以融合成1个携带blaOXA-48和blaKPC-2基因的更大的质粒。携带不同碳青霉烯类耐药基因的质粒可以通过基因重组、重排和融合质粒的形成而进行转移,导致CR-hvKP的耐药机制更加复杂。

3.2CRKP 获得hvKP携带的高毒力质粒 与高毒力菌株相比,多重耐药菌株更容易通过染色体重组产生广泛的表面多糖位点,更容易获得毒力质粒[25]。因此,通过移动毒力基因的水平转移,CRKP很容易进化为CR-hvKP。多项研究表明,获得pLVPK/pLVPK-like毒力质粒后,CRKP的毒力可以显著增强[26-27]。2018年中国一家医院报道了ST11 CR-hvKP的暴发,5例患者感染CR-hvKP后死于严重肺炎,研究人员发现,所有CR-hvKP分离株的拉丝试验结果均呈阳性,并在中性粒细胞杀伤试验中显示出高毒力,此外,这些CR-hvKP分离株都携带170 kbp的pLVPK-like毒力质粒[3]。hvKP的毒力质粒可以单独水平转移到ST11型CRKP上,也可以与IncF质粒结合形成ST11型CR-hvKP[28]。有趣的是,BOLOURVHI等[24]研究报道2株CR-hvKP由携带非结合毒力质粒的hvKP获得携带碳青霉烯耐药基因的质粒进化而来。最新研究表明,非结合毒力质粒可以整合其他携带结合转移基因的质粒,提高自身的传播能力。当这种新的结合质粒转移到大肠杆菌EC600或其他类型的KP时,其在小鼠感染模型中的毒力潜力可以显著提高[29]。这些CR-hvKP在获得毒力质粒后,表现出较强的毒力,具有高毒力传播能力[28],更容易在医院或社区引起暴发。

3.3Omp缺失产生耐药表型 Omp是存在于KP等革兰阴性菌细胞外膜上的非特导性的、能跨越细胞膜的孔道蛋白,一些抗菌药物可经Omp进入细菌体内从而发挥杀菌作用。OmpC、OmpD、OmpE、OmpF和PhoE是临床大肠杆菌中常见的Omp[30]。属于OmpC家族的OmpK36和属于OmpF家族的OmpK35在KP中很常见。在CRKP中,OmpK35和OmpK36水平的改变会产生重要影响。低水平OmpK35是超广谱β-内酰胺酶(ESBL)产CRKP耐药的重要机制之一。OmpK36可降低CRKP对ESBL和β-内酰胺酶(AmpC)的灵敏度,与CRKP对碳青霉烯类耐药密切相关。仅仅缺乏Omp不会导致KP对亚胺培南耐药,只会增加其最低抑菌浓度(MIC)。只有在合并其他抗药性机制时,KP才能对亚胺培南耐药,通常与高水平产ESBLs或AmpC酶耐药机制共同作用引起KP对亚胺培南耐药。2009年,一项对28株CRKP的研究发现,9株耐厄他培南水平较高的CRKP始终缺乏OmpK35和OmpK36[31]。对OmpK35和OmpK36基因的测序显示,大多数分离株存在不同类型的破坏,包括点突变或插入序列(IS)突变,如IS1和IS10,这表明CRKP的碳青霉烯抗性特征可能受这些Omp突变的影响。2010年WEBSTER等[32]研究报道,同时丢失Omp K35和Omp K36可能使KP对美罗培南具有完全抗性。2015年ZHANG等[15]从血液标本中分离出的CR-hvKP,该菌株对亚胺培南高度耐药,并证实其耐药机制为 OmpK35、OmpK36 水平降低,并产生ESBLs。

3.4KP获得携带毒力和碳青霉烯耐药基因的融合质粒 近年来,许多研究报道了KP通过获得杂交质粒进化为CR-hvKP。杂交质粒的形成有2个重要的机制:一种是2个单链片段在特殊的融合位点发生变化形成杂交质粒,另一种是同源重组形成杂交质粒[28]。有研究人员在1株K2-ST86 CR-hvKP中检测到了融合质粒p17ZR-91-Vir-KPC[33]。p17ZR-91-KPC质粒是由携带blaKPC-2基因的圆形抗性质粒p17ZR-91-KPC在HR1和HR2同源区同源重组而成的。值得注意的是,p17ZR-91-Vir-KPC融合质粒可以在不同序列类型的菌株之间转移。ST11型hvKP可以通过获得融合质粒进化为ST11型 CR-hvKP,这是最流行的ST11型CR-hvKP的进化机制。2021年在中国的1株ST11、K64型CRKP中检测到杂交质粒pCRHV-C2244,该质粒携带一系列毒力基因,包括iroBCDN、iucABCD-iutA和rmpA2,以及碳青霉烯抗性基因blaKPC-2基因。质粒上的多个IS26序列可以调节携带blaKPC-2基因和毒力基因片段的重组,逆转质粒上的大序列片段,最终形成杂交质粒pCRHVC2244[34]。因此,基因片段与插入元件之间的重组是杂交质粒形成的一种机制。此外,毒力质粒可以整合到染色体中,使细菌进化成毒力更强的菌株。2021年EGER等[35]从1例严重感染患者的伤口中分离出2株hvKP,全基因组测序显示,高毒力基因iroBCDN、iucABCD/iutA、rmpA/A2和peg均位于插入染色体的特定区域。这表明毒力质粒可以整合到染色体中。进一步的分析表明,这些过程影响了染色体的功能,进化出的高毒菌株可以垂直传播。上述菌株染色体内整合的毒力质粒表明,hvKP可以通过向其他菌株水平转移基因进化,也可以通过垂直传播进化。

4 CR-hvKP的治疗

CR-hvKP作为耐碳青霉烯类肠杆菌(CRE)的一类细菌,目前的治疗方案大多参照CRE的治疗指南。碳青霉烯类抗菌药物是治疗CRE最为广泛使用的一线药物。美罗培南、美罗培南-法硼巴坦和亚胺培南-利巴坦通常用于儿童CRE感染疾病。总体而言,美罗培南-法硼巴坦可有效抑制产KPC酶的CRE菌株生长,具有较高的临床治愈率和较低的副作用,特别是肾毒性较低。PASCALE等[36]指出,高剂量持续输注美罗培南是治疗特殊情况下CRE的明智选择。然而,碳青霉烯类抗菌药物的使用导致耐碳青霉烯类生产菌株的数量增加,增强了临床治疗的难度。一些新的抗CRE的抗菌药物也是治疗CRE感染的良好选择,包括头孢他啶-阿维巴坦、替加环素联合疗法和多黏菌素。使用头孢他啶-阿维巴坦治疗CRKP在临床治愈率和生存率方面表现出良好的治疗效果。然而,头孢他啶水解活性高和OmpK35缺乏可能导致产KPC酶的ST11型 CRKP对头孢他啶-阿维巴坦的灵敏度降低。因此,考虑到不同地区的流行病学情况和菌株产酶的特点,临床用药应因地制宜。

5 结语及展望

CR-hvKP在许多国家已经普遍存在,其治疗选择也相对有限。质粒的转移及质粒在细菌间的融合和重组是CR-hvKP高突变率和高传播率的关键因素。今后的研究还应关注整合到染色体上的CR-hvKP毒力质粒的垂直传播,这可能会为研究CR-hvKP的分子机制带来新的发现。